TMEM8A

TMEM8A
Identifikatori
Aliasi	PGAP6
Vanjski ID-jevi	MGI: 1926283 HomoloGene: 10944 GeneCards: PGAP6
Lokacija gena (miš)
Hrom.	Hromosom 17 (miš)
Kraj	26,342,228 bp
Ontologija gena
Molekularna funkcija	• GO:0001948, GO:0016582 vezivanje za proteine; • phospholipase A2 activity; • hydrolase activity; • molekularna funkcija;
Ćelijska komponenta	• integral component of membrane; • integral component of plasma membrane; • Egzosom; • membrana; • Lizozom; • lysosomal membrane; • ćelijska membrana;
Biološki proces	• Ćelijska adhezija; • GO:0022610 biološki proces;
	Izvori:Amigo / QuickGO
Ortolozi
	58986
	60455
	n/a
	ENSMUSG00000024180
	Q9HCN3
	Q9ESN3
	NM_021259
	NM_021793
	NP_067082
	NP_068565
	Wikipodaci
Pogledaj/uredi – čovjek	Pogledaj/uredi – miš

Transmembranski protein 8A je protein koji je kod ljudi kodiran genom TMEM8A (16p13.3.). Evolucijski, ortolozi TMEM8A nalaze se u primata i ostalih sisara te u nekoliko udaljenijih vrsta. TMEM8A sadrži pet transmembranskih domena i jedan EGF-sličan domen, od kojih su svi visoko konzervirani u ortolognom prostoru. Iako ne postoji potvrđena funkcija TMEM8A, analizom ekspresije i eksperimentalnih podataka predviđa se da je TMEM8A adhezijski protein koji ima ulogu u zadržavanju T-ćelija u stanju mirovanja.

Aminokiselinska sekvenca

Dužina polipeptidnog lanca je 771 aminokiselina, a molekulska težina 84.761 Da ^[4].

10	20	30	40	50
MGRAGTGTGG	EAVAAVVAGP	LLLLLLARPP	PASAGYSGKS	EVGLVSEHFS
QAPQRLSFYS	WYGSARLFRF	RVPPDAVLLR	WLLQVSRESG	AACTDAEITV
HFRSGAPPVI	NPLGTSFPDD	TAVQPSFQVG	VPLSTTPRSN	ASVNVSHPAP
GDWFVAAHLP	PSSQKIELKG	LAPTCAYVFQ	PELLVTRVVE	ISIMEPDVPL
PQTLLSHPSY	LKVFVPDYTR	ELLLELRDCV	SNGSLGCPVR	LTVGPVTLPS
NFQKVLTCTG	APWPCRLLLP	SPPWDRWLQV	TAESLVGPLG	TVAFSAVAAL
TACRPRSVTI	QPLLQSSQNQ	SFNASSGLLS	PSPDHQDLGR	SGRVDRSPFC
LTNYPVTRED	MDVVSVHFQP	LDRVSVRVCS	DTPSVMRLRL	NTGMDSGGSL
TISLRANKTE	MRNETVVVAC	VNAASPFLGF	NTSLNCTTAF	FQGYPLSLSA
WSRRANLIIP	YPETDNWYLS	LQLMCPENAE	DCEQAVVHVE	TTLYLVPCLN
DCGPYGQCLL	LRRHSYLYAS	CSCKAGWRGW	SCTDNSTAQT	VAQQRAATLL
LTLSNLMFLA	PIAVSVRRFF	LVEASVYAYT	MFFSTFYHAC	DQPGEAVLCI
LSYDTLQYCD	FLGSGAAIWV	TILCMARLKT	VLKYVLFLLG	TLVIAMSLQL
DRRGMWNMLG	PCLFAFVIMA	SMWAYRCGHR	RQCYPTSWQR	WAFYLLPGVS
MASVGIAIYT	SMMTSDNYYY	THSIWHILLA	GSAALLLPPP	DQPAEPWACS
QKFPCHYQIC	KNDREELYAV	T

Simboli

C: Cistein
D: Asparaginska kiselina
E: Glutaminska kiselina
F: Fenilalanin
G: Glicin
H: Histidin
I: Izoleucin
K: Lizin
L: Leucin
M: Metionin
N: Asparagin
P: Prolin
Q: Glutamin
R: Arginin
S: Serin
T: Treonin
V: Valin
W: Triptofan
Y: Tirozin

Gen

Lokus

Ljudski gen TMEM8A nalazi se na hromozomu 16, u pojasu 16p13.3.^[5]

^[6]

Raspon ovog gena na hromosomu 16 proteže se od baznog para 420.773 do 437.113, što čini da ovaj gen ima 16.340 baznih parova. Ovaj gen nalazi se na minus lancu hromosoma.^[7] Nema pozmatih izoformi.

Alijasi

TMEM8A je poznat i kao transmembranski protein 8A, transmembranski protein 6, petoslojni transmembranski protein M83, TMEM6, TMEM8, transmembranski protein 8 i M83.^[8]

Homologija

Paralozi

Postoje dva paraloga za TMEM8A pronađena kod ljudi, C9orf127 i TMEM8C. Oba nalaze se na hromosomu 9.^[9]

Ortolozi

Prostor ortologa TMEM8A prilično je uzak, s većinom kod sisara, a posebno primata, uz samo nekoliko izuzetaka.

Rod i vrsta^[9]	Uobičajeno ime	Razred	Pristup	Postotak identiteta
Pan troglodytes	Čimpanza	Mammalia	XP_510709	99%
Pongo abelii	Orangutan	Mammalia	XP_002825960	97%
Macaca mulatta	Rezus majmun	Mammalia	XP_001118461	93%
Callithrix jacchus	Marmozet	Mammalia	ABZ80344	93%
Rattus norvegicus	Pacov	Mammalia	XP_001070176	43%
Bos taurus	Govedo	Mammalia	NP_001092377	69%
Ailuropoda melanoleuca	Panda	Mammalia	EFB17134	78%
Canis familiaris	Pad	Mammalia	XP_003639163	74%
Equus caballus	Konj	Mammalia	XP_001915452	78%
Felis catus	Mačka	Mammalia	XP_003999121	75%
Monodelphis domestica	Oposum	Mammalia	XP_001378110	44%
Ornithorhynchus anatinus	Kljunar	Mammalia	XP_001512398	50%
Gallus gallus	Kokoš	Aves	XP_003643243	56%
Anolis carolinensis	Gušter	Reptilia	XP_003230229	53%
Xenopus tropicalis	Žaba	Amphibia	XP_002943473	43%
Takifugo rubripes	Pufer-riba	Actinopterygii	XP_003975883	44%
Danio rerio	Zebrica	Acrinoptergii	XP_00139040	44%
Strongylacentrotus putputatus	Moprski jež	Echinoidea	XP_795452	29%
Drosophila melanogaster	Vinska mušica	Insecta	NP_651350	36%

Protein

Primarna sekvenca

Gen kodira protein koji se naziva i TMEM8A. Ovaj protein dug je 771 aminokiselinu, ali pokazalo se da ima peptidni signal od aminokiselina 1 do 34; zreli oblik proteina je dugačak samo 737 aminokiselina. Oblik prekursora s netaknutim peptidnim signalom ima molekulsku težinu od 84.780 kilodaltona, a zreli oblik s cijepanim signalnim peptidom ima molekulsku težinu od 81.624 kilodaltona.^[10] TMEM8A has an isoelectric point of the mature form of pI=7.3.^[11]

Domeni i motivi

TMEM8A je transmembranski protein sa pet transmembranskih domena, što ga čini jednim od samo tri proteina koji se nalaze u ljudskom tijelu s pet domena; druga dva su CD47 i AC133. Protein također sadrži EGF-slični domen, koji je sekvenca od oko trideset do četrdeset aminokiselinskih ostataka, u sekvenci epidermnog faktora rasta (EGF), za koju se pokazalo da je prisutna u više ili manje konzerviranom obliku u velikom broju drugih, uglavnom životinjskih, proteina. Funkcionalni značaj EGF domena u onome što se čini kao nepovezani proteini još nije jasan. Međutim, zajednička karakteristika je da se ova ponavljanja nalaze u vanćelijskim domenu membranski vezanih proteina ili u proteinima za koje se zna da se luče. EGF domen uključuje šest ostataka cisteina za koje je dokazano (u EGF-u) da su uključeni u disulfidne veze. Glavna struktura je dvolančani beta-list, praćen petljom do kratkog dvo-lančanog C-terminala. Poddomeni između konzerviranih cisteina variraju u dužini.^[12]

Posttranslacijske modifikacije

Pokazalo se da protein posttranslacijski prolazi glikozolaciju na aminokiselinama 144, 407 i 431. Postoje i tri disulfidne veze između aminokiselina 498 i 508, 502 i 521 i 523 i 532. Sve ove disulfidne veze su karakteristične za proteine s domenom sličnim EGF-u.

Sekundarna struktura

Ekspresija

Utvrđeno je da se TMEM8A sveprisutno ispoljava u čitavom ljudskom tijelu; međutim, pokazalo se da je regulirano tokom CD4 + i CD8 + aktivacije T-ćelija.^[13]

Varijante transkripta

Postoje tri prirodne varijante transkripta TMEM8A. Jedan se nalazi na aminokiselini 136, gdje se treonin zamenjuje alaninom. Druga je prisutna u aminokiselini 310, gdje se izoleucin zamjenjuje valinom, a jedna u aminokiselini 567, gdje se arginin zamjenjuje za triptofan. Nijedna od ovih varijanti ne rezultira promjenom ekspresije niti bilo kakvim gubitkom/dobitkom funkcije mutacija.^[14]

Funkcija

Lee et al. (2016) otkrili su da je PGAP6 uključen u obradu GPI-usidrenih proteina (GPI-AP), jer je prekomjerna ekspresija PGAP6 značajno smanjila količinu GPI-AP na površini CHO 3B2A ćelija. CRIPTO, ali ne i član njegove uže porodice CRYPTIC (CFC1), bio je vrlo osjetljiv na PGAP6. Površinska ekspresija CRIPTO-a bila je snažno smanjena, a lučenje CRIPTO-a pojačano, prekomjernom ekspresijom PGAP6, dok je destrukcija PGAP6 imala suprotne efekte. PGAP6 je imao GPI-specifičnu aktivnost fosfolipaze A2, a PGAP6 je obrađivao CRIPTO i oslobađao ga kao oblik koji nosi lizofosfatidilinozitol i koji je dalje cijepan fosfolipazom D (GPLD1). CRIPTO koji eksprimira PGAP6 funkcionirao je kao NODALni koreceptor i modulirao i cis i trans NODAL signalizaciju, a ekspresija PGAP6 također je smanjila aktivnost CRIPTO-a povezanu sa ćelijama. Korištenjem CRIPTO-CRYPTIC himernih proteina, Lee et al. (2020) pokazali su da je CFC domen CRIPTO, posebno regija C-terminala, odredio osjetljivost CRIPTO-a na PGAP6. N-terminalni domen PGAP6 specifično je djelovao s CFC domenom CRIPTO i razlikovo se od domene CRYPTIC za obradu. PGAP6 je pokazao usku specifičnost za ljudske GPI-AP, jer su samo CRIPTO, GPC3, prostazin (PRSS8), SPACA4 i kontaktin-1 (CNTN1) bili osjetljivi na PGAP6. Transfekcija PGAP6 u ćelijema CHO, oštećenih GPI transamidazom , koja veže GPI na proteine, pokazala je smanjeni nivo slobodnog GPI za 88%. Nalazi sugeriraju da PGAP6 pristupa GPI kada proteinski dio ne postoji i da proteinski dijelovi većine GPI-AP, uz nekoliko izuzetaka, sprečavaju pristup PGAP6 GPI dijelu.^[15]

Životinjski model

Lee et al. (2016) otkrili su da su miševi s mutacijama u GPI biosintetskim genima Pign i Pgap1, koji imaju neispravnu Cripto signalizaciju i holoprosencefaliju, pokazali oštećenu sekreciju Cripto-ovisnog o Pgap6. Miševi Pgap6 –/– imali su nedostatke u ranom razvoju embriona, posebno u formiranju prednje-zadnje osi, što sugerira da je Pgap6 presudan za funkciju Cripto i regulira stvaranje prednje-stražnje osi u embrionima miša.^[16]^[17]

Interaktivni proteini

Faktori transkripcije

Mnogo je predviđenih mjesta vezivanja faktora transkripcije u promotoru TMEM8A. Ispod je tabela najboljih mogućnosti koje imaju visoke vrijednosti pouzdanosti, evolucijsku konzerviranost i/ili više mogućih mjesta vezivanja u promotoru.

Transkripcijski faktor	Start	Kraj	Lanac	Sekvenca
Insulimom-asocirani faktori	1	13	+	tggagGGGGtccg
Gen 1 plemorfnog adenoma	3	25	+	gaGGGGgtccgggtggcagtgcg
Hipermetiliran u kanceru 1	11	23	–	cacTGCCacccgg
Cinkov prst sa KRAB i SCAN domenima 3	15	37	–	gccatCCCCacccgcactgccac
Nedostajući homolog 1 ćelija glije	18	32	+	ccccaCCCGcactgc
Bazni krueppel-oliki faktor (KLF3)	19	35	+	cagtgcGGGTggggatg
Protein cinkovog prste Spalt-2, sal-liki 2, p150(sal2)	23	33	+	gcgggtGGGGatg
MYC-asocirani protein cinkovog prsta srodan transkripcijskom faktoru	23	35	+	gcgggtGGGGatg
Protein MZF1 mijeloidnog cinkovog prsta	27	37	+	gtGGGGatggc
Hipermetilirani u kanceru 1	29	41	–	gacTGCCatcccc
Yin i Yangovo aktivacijsko mjesto 1	38	60	–	gacactgCCATcgccactctgact
Y-boks vezujući protein 1, koji ima prednost za vezivanje ssDNK	41	53	+	cagagTGGCgatg
Nedostajući homolog 1 ćelija glije	54	68	–	cgccaCCCGcactgc
Supresor Wilmsovog tumora	71	84	+	ggcagtgTGGGtggcga
Transkripcijski faktor 2 / CBFA1 povezan sa runtom (faktor vezanja jedra, domen runta, alfa podjedinica 1)	73	87	+	cagtGTGGgtggcga
Član GLI3 GLI-Kruppelske porodice	74	88	–	atcgCCACccacact
Cinkov prst sa KRAB i SCAN domenima 3	87	103	–	gccatCCCCacccgcactgccat

Interakcije

Mreža proteinske interakcije TMEM8A

Dokazano je da TMEM8A komunicira sa sljedećim proteinima:

ALPL
NDUFS5
NME4
MACF1
G5
ENSG00000234651
ENSG00000237431
ENSG00000237495

Reference

^ ^a ^b ^c GRCm38: Ensembl release 89: ENSMUSG00000024180 - Ensembl, maj 2017
^ "Human PubMed Reference:". National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine.
^ "Mouse PubMed Reference:". National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine.
^ "UniProt, Q9HCN3". Pristupljeno 10. 7. 2021.
^ Martin J, Han C, Gordon LA, Terry A, Prabhakar S, She X, Xie G, Hellsten U, Chan YM, Altherr M, Couronne O, Aerts A, Bajorek E, Black S, Blumer H, Branscomb E, Brown NC, Bruno WJ, Buckingham JM, Callen DF, et al. (decembar 2004). "The sequence and analysis of duplication-rich human chromosome 16" (PDF). Nature. 432 (7020): 988–94. Bibcode:2004Natur.432..988M. doi:10.1038/nature03187. PMID 15616553. S2CID 4362044.
^ Dib C, Fauré S, Fizames C, Samson D, Drouot N, Vignal A, Millasseau P, Marc S, Hazan J, Seboun E, Lathrop M, Gyapay G, Morissette J, Weissenbach J (1996). "A comprehensive genetic map of the human genome based on 5,264 microsatellites". Nature. 380 (6570): 152–4. Bibcode:1996Natur.380..152D. doi:10.1038/380152a0. PMID 8600387. S2CID 28950185.
^ Daniels RJ, Peden JF, Lloyd C, Horsley SW, Clark K, Tufarelli C, Kearney L, Buckle VJ, Doggett NA, Flint J, Higgs DR (februar 2001). "Sequence, structure and pathology of the fully annotated terminal 2 Mb of the short arm of human chromosome 16". Hum. Mol. Genet. 10 (4): 339–52. doi:10.1093/hmg/10.4.339. PMID 11157797.
^ https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=TMEM8A&ortholog=all#orthologs
^ ^a ^b Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (oktobar 1990). "Basic local alignment search tool". J. Mol. Biol. 215 (3): 403–10. doi:10.1016/S0022-2836(05)80360-2. PMID 2231712.
^ "Tmem8 transmembrane protein 8 [Mus musculus (house mouse)] - Gene - NCBI".
^ Brendel V, Bucher P, Nourbakhsh IR, Blaisdell BE, Karlin S (mart 1992). "Methods and algorithms for statistical analysis of protein sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (6): 2002–6. Bibcode:1992PNAS...89.2002B. doi:10.1073/pnas.89.6.2002. PMC 48584. PMID 1549558.
^ Kansas GS, Saunders KB, Ley K, Zakrzewicz A, Gibson RM, Furie BC, Furie B, Tedder TF (februar 1994). "A role for the epidermal growth factor-like domain of P-selectin in ligand recognition and cell adhesion". J. Cell Biol. 124 (4): 609–18. doi:10.1083/jcb.124.4.609. PMC 2119911. PMID 7508943.
^ Motohashi T, Miyoshi S, Osawa M, Eyre HJ, Sutherland GR, Matsuda Y, Nakamura Y, Shibuya A, Iwama A, Nakauchi H (septembar 2000). "Molecular cloning and chromosomal mapping of a novel five-span transmembrane protein gene, M83". Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1): 244–50. doi:10.1006/bbrc.2000.3409. hdl:2241/1570. PMID 11006113.
^ Ota T, Suzuki Y, Nishikawa T, et al. (januar 2004). "Complete sequencing and characterization of 21,243 full-length human cDNAs". Nat. Genet. 36 (1): 40–5. doi:10.1038/ng1285. PMID 14702039.
^ Lee, G.-H., Fujita, M., Nakanishi, H., Miyata, H., Ikawa, M., Maeda, Y., Murakami, Y., Kinoshita, T. PGAP6, a GPI-specific phospholipase A2, has narrow substrate specificity against GPI-anchored proteins. J. Biol. Chem. 295: 14501-14509, 2020. PubMed: 32816994
^ Lee, G.-H., Fujita, M., Takaoka, K., Murakami, Y., Fujihara, Y., Kanzawa, N., Murakami, K., Kajikawa, E., Takada, Y., Saito, K., Ikawa, M., Mamada, H., Maeda, Y., Kinoshita, T. A GPI processing phospholipase A2, PGAP6, modulates Nodal signaling in embryos by shedding CRIPTO. J. Cell Biol. 215: 705-718, 2016. PubMed: 27881714
^ Motohashi, T., Miyoshi, S., Osawa, M., Eyre, H. J., Sutherland, G. R., Matsuda, Y., Nakamura, Y., Shibuya, A., Iwama, A., Nakauchi, H. Molecular cloning and chromosomal mapping of a novel five-span transmembrane protein gene, M83. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276: 244-250, 2000. PubMed: 11006113

[refGRCm38Ensembl-1] GRCm38: Ensembl release 89: ENSMUSG00000024180 - Ensembl, maj 2017

[2] "Human PubMed Reference:". National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine.

[3] "Mouse PubMed Reference:". National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine.

[UniProt-4] "UniProt, Q9HCN3". Pristupljeno 10. 7. 2021.

[pmid15616553-5] Martin J, Han C, Gordon LA, Terry A, Prabhakar S, She X, Xie G, Hellsten U, Chan YM, Altherr M, Couronne O, Aerts A, Bajorek E, Black S, Blumer H, Branscomb E, Brown NC, Bruno WJ, Buckingham JM, Callen DF, et al. (decembar 2004). "The sequence and analysis of duplication-rich human chromosome 16" (PDF). Nature. 432 (7020): 988–94. Bibcode:2004Natur.432..988M. doi:10.1038/nature03187. PMID 15616553. S2CID 4362044.

[pmid-6] Dib C, Fauré S, Fizames C, Samson D, Drouot N, Vignal A, Millasseau P, Marc S, Hazan J, Seboun E, Lathrop M, Gyapay G, Morissette J, Weissenbach J (1996). "A comprehensive genetic map of the human genome based on 5,264 microsatellites". Nature. 380 (6570): 152–4. Bibcode:1996Natur.380..152D. doi:10.1038/380152a0. PMID 8600387. S2CID 28950185.

[pmid11157797-7] Daniels RJ, Peden JF, Lloyd C, Horsley SW, Clark K, Tufarelli C, Kearney L, Buckle VJ, Doggett NA, Flint J, Higgs DR (februar 2001). "Sequence, structure and pathology of the fully annotated terminal 2 Mb of the short arm of human chromosome 16". Hum. Mol. Genet. 10 (4): 339–52. doi:10.1093/hmg/10.4.339. PMID 11157797.

[8] ttps://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=TMEM8A&ortholog=all#orthologs

[Altschul_1990-9] Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (oktobar 1990). "Basic local alignment search tool". J. Mol. Biol. 215 (3): 403–10. doi:10.1016/S0022-2836(05)80360-2. PMID 2231712.

[10] "Tmem8 transmembrane protein 8 [Mus musculus (house mouse)] - Gene - NCBI".

[pmid1549558-11] Brendel V, Bucher P, Nourbakhsh IR, Blaisdell BE, Karlin S (mart 1992). "Methods and algorithms for statistical analysis of protein sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (6): 2002–6. Bibcode:1992PNAS...89.2002B. doi:10.1073/pnas.89.6.2002. PMC 48584. PMID 1549558.

[pmid7508943-12] Kansas GS, Saunders KB, Ley K, Zakrzewicz A, Gibson RM, Furie BC, Furie B, Tedder TF (februar 1994). "A role for the epidermal growth factor-like domain of P-selectin in ligand recognition and cell adhesion". J. Cell Biol. 124 (4): 609–18. doi:10.1083/jcb.124.4.609. PMC 2119911. PMID 7508943.

[pmid11006113-13] Motohashi T, Miyoshi S, Osawa M, Eyre HJ, Sutherland GR, Matsuda Y, Nakamura Y, Shibuya A, Iwama A, Nakauchi H (septembar 2000). "Molecular cloning and chromosomal mapping of a novel five-span transmembrane protein gene, M83". Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1): 244–50. doi:10.1006/bbrc.2000.3409. hdl:2241/1570. PMID 11006113.

[pmid14702039-14] Ota T, Suzuki Y, Nishikawa T, et al. (januar 2004). "Complete sequencing and characterization of 21,243 full-length human cDNAs". Nat. Genet. 36 (1): 40–5. doi:10.1038/ng1285. PMID 14702039.

[15] Lee, G.-H., Fujita, M., Nakanishi, H., Miyata, H., Ikawa, M., Maeda, Y., Murakami, Y., Kinoshita, T. PGAP6, a GPI-specific phospholipase A2, has narrow substrate specificity against GPI-anchored proteins. J. Biol. Chem. 295: 14501-14509, 2020. PubMed: 32816994

[16] Lee, G.-H., Fujita, M., Takaoka, K., Murakami, Y., Fujihara, Y., Kanzawa, N., Murakami, K., Kajikawa, E., Takada, Y., Saito, K., Ikawa, M., Mamada, H., Maeda, Y., Kinoshita, T. A GPI processing phospholipase A2, PGAP6, modulates Nodal signaling in embryos by shedding CRIPTO. J. Cell Biol. 215: 705-718, 2016. PubMed: 27881714

[17] Motohashi, T., Miyoshi, S., Osawa, M., Eyre, H. J., Sutherland, G. R., Matsuda, Y., Nakamura, Y., Shibuya, A., Iwama, A., Nakauchi, H. Molecular cloning and chromosomal mapping of a novel five-span transmembrane protein gene, M83. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276: 244-250, 2000. PubMed: 11006113

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]

[15]

[16]

[17]