Pirosekvenciranje

Pirosekvenciranje je metod sekvenciranja DNK (određivanje redoslijeda nukleotida u DNK), zasnovan na principu "sekvenciranja sintezom", u kojem se sekvenciranje izvodi otkrivanjem nukleotida inkorporiranih pomoću DNK-polimeraza. Pirosekvenciranje se oslanja na detekciju svjetlosti na osnovu lančane reakcije kada se oslobodi pirofosfat. Otuda i naziv pirosekvenciranje.

Princip pirosekvenciranja prvi je put opisan 1993. godine, , što su otkrili Bertil Pettersson, Mathias Uhlen and Pål Nyrén kombinovanjem metoda sekvenciranja čvrste faze. Koristili sui streptavidinom obložene magnetne kuglice s rekombinantnom DNK-polimerazom kojoj nedostaje 3´ do 5´ egzonukleazna aktivnost (lektoriranje) i detekciju luminescencije pomoću enzima luciferaze svjetlaca. Dodaje se mješavina tri enzima (DNK-polimeraza, ATP sulfurilaza i svjetlačka luciferaza) i nukleotida (dNTP) na jednolančanu DNK koju treba sekvencirati, a ugrađivanje nukleotida je praćeno mjerenjem emitirane svjetlosti. Intenzitet svjetlosti određuje da li je ugrađeno 0, 1 ili više nukleotida, pokazujući na taj način koliko je komplementarnih nukleotida prisutno na lancu šablona. Smjesa nukleotida se uklanja prije dodavanja sljedeće smjese nukleotida. Ovaj proces se ponavlja sa svakim od četiri nukleotida dok se ne odredi sekvenca DNK jednolančanog šablona.

Drugi metod za pirosekvencirasnje zasnovan na rastvoru opisali su Mostafa Ronaghi, Mathias Uhlen i Pål Nyren, 1998. godine., [https://www.kth.se/en/bio/research/proteomics/proteomics-researchers/mathias-uhlen-1.67763 U U ovom alternativnom metodu, uvodi se dodatni enzim apiraza, za uklanjanje nukleotida koji nisu ugrađeni u DNK-polimerazu. Ovo je omogućilo da se mešavina enzima uključujući DNK-polimerazu, luciferazu i apirazu doda na početku i zadrži tokom čitave procedure, čime se obezbeđuje jednostavno podešavanje pogodno za automatizaciju. Automatizirani instrument zasnovan na ovom principu na tržište je sljedeće godine uvela kompanija Pyrosequencing.

Treća mikrofluidna varijanta metode pirosekvencije opisana je u 2005 šrto su učinili Jonathan Rothberg i saradnici u kompaniji 454 Life Sciences. Ovaj alternativni pristup pirosekvenciranja bio je zasnovan na originalnom principu vezivanja DNK za sekvencioniranje na čvrsti nosač; pokazali su da se sekvenciranje može izvesti na vrlo paralelan način pomoću mikrofabriciranih mikronizova. To je omogućilo visoko propusno sekvenciranje DNK i automatizirani instrument je uveden na tržište. Ovo je postao prvi instrument za sekvenciranje sljedeće generacije koji je započeo novu eru u istraživanju genomike, sa rapidnim padom cijena za sekvenciranje DNK, omogućavajući sekvenciranje cijelog genoma po pristupačnim cijenama.

Procedura

Grafikon pokazuje kako funkcionira pirosekvenciranje

"Sekvenciranje sintezom" uključuje uzimanje jednog lanca DNK za sekvencioniranje, a zatim enzimsku sintezu njegovog komplementarnog lanca. Metod pirosekvenciranja zasniva se na detekciji aktivnosti DNK-polimeraza (enzima koji sintetišu DNK) sa drugim hemoluminiscentnim enzimom. U suštini, metod omogućava sekvenciranje jednog lanca DNK, sintetiziranjem komplementarnog lanca duž njega, jedan po jedan bazni par, i otkrivanjem koja je baza zapravo dodana u svakom koraku. DNK šablona je nepomična, a rastvori A, C, G i T nukleotida se uzastopno dodaju i uklanjaju iz reakcije. Svjetlost se proizvodi samo kada otopina nukleotida dopuni prvu nesparenu bazu šablona. Redoslijed rastvira koji proizvode hemiluminiscentne signale omogućava određivanje sekvence šablona.

Za verziju pirosekvenciranja zasnovanog na rastvoru, šablon jednolančane DNK (ssDNK) je hibridizovan u sekvencioni [prajmer]] i inkubiran sa enzimima DNK-polimeraza, ATP-sulfurilaza, luciferaza i apiraza, te sa supstratima adenozin 5´ fosfosulfat (APS) i luciferin.

1. Dodatak jednog od četiri deoksinukleotid-trifosfata (dNTP) (dATPαS, koji nije supstrat za luciferazu, dodaje se umjesto dATP da bi se izbjegao šum) inicira drugi korak. DNK-polimeraza uključuje ispravne, komplementarne dNTP na šablonu. Ova inkorporacija oslobađa pirofosfat (PPi).
2. ATP-sulfurilaza pretvara PPi u ATP u prisustvu adenozin 5´ fosfosulfata. Ovaj ATP djeluje kao supstrat za luciferazom posredovanu konverziju luciferina u oksiluciferin koja stvara vidljivo svjetlo u količinama koje su proporcionalne količini. Svjetlo proizvedeno u reakciji kataliziranoj luciferazom detektira se kamerom i analizira u programu.
3. Neinkorporirane nukleotide i ATP razgrađuje apiraza i reakcija može ponovo započeti s drugim nukleotidom.

Proces se može predstaviti sljedećim jednačinama:

• PPi + APS → ATP + sulfat (katalizira ATP-sulfurilaza);
• ATP + luciferin + O2 → AMP + PPi + oksiluciferin + CO2 + hv (katalizuje luciferaza);

gdje:

• PPi = pirofosfat
• APS = adenozin 5-fosfosulfat;
• ATP = adenozin trifosfat;
• O2 = molekula kisika;
• AMP = adenozin-monofosfat;
• CO2 =ugljik-dioksid;
• hv = svjetlost.

Ograničenja

Do sada, ograničenje metoda je da su dužine pojedinačnih očitavanja DNK sekvence u blizini 300–500 nukleotida, kraće od 800–1000 koje se mogu dobiti metodom završetaka lanca (npr. Sangerovsko sekvenciranje). Ovo može otežati proces sastavljanja genoma, posebno za sekvence koje sadrže veliku količinu ponavljajuće DNK. Nedostatak lekture ograničava preciznost ovog metoda.

Komercijalizacija

Kompanija Pyrosequencing AB u Uppsali osnovana je sa rizičnim kapitalom koji je obezbijedio HealthCap u cilju komercijalizacije mašina i reagensa za sekvenciranje kratkih dijelova DNK, korištenjem tehnika pirosekvenciranja. Pyrosequencing AB je uvršten na Stockholm Stock Exchange 1999. godine. Preimenovan je u Biotage, 2003. Qiagen je kupio poslovnu liniju pirosekvenciranja 2008. Tehnologija pirosekvenciranja je dodatno licencirana za 454 Life Sciences. 454 je razvio tehnologiju pirosekvenciranja zasnovanu na sekvednci koja se pojavila kao platforma za visokopropusno sekvencioniranje DNK, uključujući sekvenciranje genoma i metagenomiku.

Roche najavio je ukidanje platforme za sekvenciranje 454, u 2013.

Reference

Dopunska literatura

• Metzker M. (2005). "Emerging Technologies in DNA Sequencing". Genome Research. 15 (12): 1767–76. doi:10.1101/gr.3770505. PMID 16339375.