Taq polimeraza
Polimeraza Taq je vrsta termostabilne DNK polimeraze, koja je tako imenovana po tome što je proizvedena iz bakterije Thermus aquaticus (T-aq) i iz koje ju je 1968. godine izolirao Thomas D. Brock. Veoma često se skraćeno označava kao Taq pol (ili jednostavno kao Taq). Najčešće se upotrebljava u procesu polimerazne lančane reakcije (PCR), proceduri koja se koristi za umnožavanje kratkih sekvenci DNK.[1][2][3]
| Taq polimeraza Egzonukleaza | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Veza DNK polimeraze za oktamer DNK | |||||||||
| Identifikatori | |||||||||
| Simbol | Taq-exonuc | ||||||||
| Pfam | PF09281 | ||||||||
| InterPro | IPR015361 | ||||||||
| SCOP2 | 1qtm / SCOPe / SUPFAM | ||||||||
| |||||||||
| Taq-exonuc | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 DNK polimeraza | |||||||||
| Identifikatori | |||||||||
| Simbol | Taq-exonuc | ||||||||
| Pfam | PF09281 | ||||||||
| InterPro | IPR015361 | ||||||||
| SCOP2 | 1qtm / SCOPe / SUPFAM | ||||||||
| |||||||||
Thermus aquaticus je bakterija koja živi u toplim izvorima i hidrotermalnih odušcima. Polimeraza Taq se odlikuje ekstremoenzimnom sposobnošću da izdrži visoke temperature koje su potrebne u procesu PCR, bez denaturacije. Iz tog razloga je zamijenila DNK polimerazu iz Escherichia coli (Eko pol) koja je prvobitno korištena u ovoj tehnici, ali je bilo potrebno da se zamijeni nakon svakog ciklusa zagrijavanja, što povećava vjerovatnoću kontaminacije i produženja potrebnog vremena. Optimalna radna temperatura za Taq je 75-80 °C, uz poluraspad veći od dva sata na 92,5 °C, 40 minuta na 95 °C, a 9 minuta na 97,5 °C. Ovaj enzim može kopirati DNK lanac od 1.000 baznih parova za manje od 10 sekundi, na radnoj temperaturi od 72 °C.
Nedostaci Taq-polimeraze su relativno niska tačnost, nedostatak lekture aktivnosti 3 '→ 5' egzonukleaze i uvodna stopa pogreške od oko 1 na 9.000 nukleotida. Međutim, preostala dva domena mogu djelovati u koordinaciji zajedničkih domenskih aktivnosti. Izolovane su i neke druge DNK polimeraze iz drugih termofilnih bakterija i archaea , kao što je polimeraza Pfu (izolovan od Pyrococcus furiosus ) čije aktivnosti imaju svrhu ispravke. Kada je potrebna visoka tačnost, ove polimeraze se koriate same ili u kombinaciji sa Taq.
Taq polimeraza u PCR
urediU ranim 1980-im godinama Kary Mullis je radio u Cetus Corporation na temu oblika primjene sintetskih DNK u biotehnologiji. On je bio upoznat sa upotrebom DNK oligonukleotida kao sonde prilikom vezivanja na specifične DNK koje sadrže posebu sekvencu nukleotida, kao i sa upotrebom ovih sondi kao inicijatora u DNK sintezi dopunskih polulanaca. Godine 1983. počeo je koristiti tehniku koja je dodala dva prajmera, po jedan za hibridizaciju sa svakom od DNK, a zatim je tokom reakcije dodana DNK polimeraza. Tako je postigao eksponencijalnu replikaciju DNK, povećavajući sadržaj sekvenci DNK dva prajmera.[4]
Međutim, nakon svakog kruga kopiranja mješavina se morala zagrijavati iznad 90 °C za denaturaciju novonastale dvolančane DNK. Time se omogućava svakoj od niti da može poslužiti kao predložak za sljedeći krug amplifikacije. Ovaj korak grijanja i inaktiviranja DNK polimeraze (u Klenowom fragmentu DNA polimeraze I iz Escherichia coli) korištena je prije otkrića polimeraze Taq.
Upotreba termostabilne polimeraze Taq uklanja potrebu za dodavanjajem novih količina polimeraze tokom termocikliranja. Zbog toga je moguće koristiti jednu zatvorenu mašinu sa toplinskom policikličnom cijevi i relativno jednostavno izvestii cijeli proces. Stoga je korištenje Taq polimeraze bilo ključna ideja koja je omogućila da se putem PCR ciklusa riješe razni problemi molekularne biologije koji se odnose na DNK analizu.[5]
Sporenje oko patenta
urediKompanija za proizvodnju lijekova Hoffmann-La Roche Cetus na kraju je kupila patente za Taq i PCR tehnike, za 330 miliona dolara. Procjenjuje se da je dobila više od 2.000 miliona dolara za tantijema zbog posjedovanje takvih patenata. U 1989. godini, elitni naučni magazin Science je polimerazu Taq proglasio svojom "molekulom godine". Kary Mullis je dobila Nobelovu nagradu za hemiju 1993. godine za istraživanje na PCR, jedinu koju dodjeljuju biotehnološke kompanije. Do ranih 1990-ih, tehnika PCR polimeraze Taq je već u upotrebi u mnogim područjima, zajedno sa osnovnim istraživanjima u molekularnoj biologiji, kliničkom genetskom testiranju i forenzici. Njena primjena postala je značajna kod direktnog otkrivanja virusa HIV u sindromu stečene imunodeficijencije, poznatijem kao SIDA.
U decembru 1999. godine, američki okružni sudija Vaughn Walker je presudio da patent iz 1990. godine kojem pripada polimeraza Taq je djelimično oštećen zlonamjernim i lažnim informacijama pritužbi naučnika Cetus Corporation. Mišljenje je dovelo do potraživanja kompanije Promega Corporation protiv Hoffmann-La Roche koji je kupio patente Taq 1991. godine. Sudija Walker je kao osnovu za svoje mišljenje naveo presedan nekoliko prethodnih nalaza iz drugih laboratorija, uključujući laboratoriju profesora Johna Trela u Sektoru bioloških nauka na Univerzitetu Cincinnati.[6] uklanjajući potrebu za dodavanjem enzima nakon svakog ciklusa termo-denaturacije DNK. Enzim je također i molekularno kloniran, DNK sekvenciran, izmijenjen (do kraćeg 'Stoffelovog fragmenta') i proizveden u velikim količinama, komercijalnih razmjera.[7] U 1989. godini, elitni časopis Science je Taq polimerazu imenovao svojom molekulom godine ("Molecule of the Year"),[8] a 1993., Kary Mullis[9] je dobio Nobelovu nagradu za hemiju.
Reference
uredi- ^ Bajrović K, Jevrić-Čaušević A., Hadžiselimović R., Ed. (2005): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 9958-9344-1-8.
- ^ Kapur Pojskić L., Ed. (2014): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju, 2. izdanje. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 978-9958-9344-8-3.
- ^ Hadžiselimović R., Pojskić N. (2005): Uvod u humanu imunogenetiku. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 9958-9344-3-4.
- ^ Alberts B. (2002)ː Molecular biology of the cell. Garland Science, New York, ISBN 0-8153-3218-1.
- ^ Chien, A; Edgar DB; Trela JM (1. 9. 1976). "Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus". J. Bact. 127 (3): 1550–7. PMC 232952. PMID 8432.
- ^ Saiki, RK; et al. (1988). "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase". Science. 239 (4839): 487–91. doi:10.1126/science.2448875. PMID 2448875. Arhivirano s originala, 19. 12. 2008. Pristupljeno 15. 4. 2016.
- ^ Lawyer FC; et al. (1993). "High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase". PCR Methods Appl. 2 (4): 275–87. doi:10.1101/gr.2.4.275. PMID 8324500.
- ^ Guyer RL; Koshland DE (decembar 1989). "The Molecule of the Year". Science. 246 (4937): 1543–6. doi:10.1126/science.2688087. PMID 2688087.
- ^ http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/mullis-lecture.html