Wikipedia

DNK-ligaza

DNK-ligaza je specifičan tip enzima, ligaza, (Šablon:EnzExplorer) koji olakšava spajanje DNK lanaca zajedno, katalizujući formiranje fosfodiesterskih veza. Ima ulogu u popravljanju jednolančanih lomova u dupleksu DNK u živim organizmima, ali neki oblici (kao što je DNK ligaza IV) mogu specifično popraviti dvolančane prekide (tj. prekid u oba komplementarna lanca DNK). Jednolančani prekidi se popravljaju pomoću DNK-ligaze koristeći komplementarni lanac dvostruke spirale kao šablon,[1] sa DNK-ligazom koja stvara konačnu fosfodiestarsku vezu za potpunu popravku DNK.

DNK-ligaza
Umjetnička koncepcija DNK ligaze koja popravlja hromosomska oštećenja
Identifikatori
SimbolDNK-lig
CAS broj9015-85-4
Ligaza I, DNK, ATP-ovisna
Identifikatori
SimbolLIG1
NCBI gen3978
HGNC6598
OMIM126391
RefSeqNM_000234
UniProtP18858
Ostali podaci
LokusHrom. 19 [1]
Pretraga za
StruktureSwiss-model
DomeneInterPro
Ligaza III, DNK, ATP-ovisna
Identifikatori
SimbolLIG3
NCBI gen3980
HGNC6600
OMIM600940
RefSeqNM_002311
UniProtP49916
Ostali podaci
LokusHrom. 17 q11.2-q12
Pretraga za
StruktureSwiss-model
DomeneInterPro
Uloga DNK-ligaze u replikaciji DNK

DNK-ligaza se koristi i u popravak DNK i replikaciju DNK (pogledajte Ligaze sisara). Pored toga, DNK ligaza ima široku upotrebu u laboratorijama molekulske biologije za eksperimente rekombinantne DNK (pogledajte . Prečišćena DNK ligaza koristi se u kloniranju gena za spajanje molekula DNK kako bi se formirala rekombinantna DNK.

Enzimski mehanizam

uredi
 
Slika pokazuje kako ligaza (žuti oval) katalizira dva lanca fragmenta DNK. Ligaza spaja dva fragmenta DNK kako bi formirala duži lanac DNK tako što ih "zalijepi" zajedno.

Mehanizam DNK ligaze je formiranje dvije kovalentne fosfodiesterske veze između 3' hidroksilnih krajeva jednog nukleotida ("akceptora"), sa 5' fosfatnog kraja drugog ("donator"). Za svaku formiranu fosfodiestersku vezu troše se dvije molekule ATP. AMP je potreban za ligaznu reakciju, koja se odvija u četiri koraka:

  1. Reorganizacija mjesta aktivnosti kao što su urezi u DNK segmentima ili Okazaki fragmentima itd.
  2. Adenililacija (dodatak AMP) lizinskog ostatka u aktivnom centru enzima, a oslobađa se pirofosfat;
  3. Prijenos AMP-a na 5' fosfat tzv. donora, stvaranje pirofosfatne veze;
  4. Formiranje fosfodiestarske veze između 5' fosfata donora i 3' hidroksilnog akceptora.[2]
 
Slikovit primjer kako ligaza funkcionira (sa ljepljivim krajevima)

Ligaza će takođe djelovati sa tupim krajem, iako su potrebne veće koncentracije enzima i različiti uslovi reakcije.

Tipovi

uredi

E. coli

uredi

Kod E. coli DNK ligazu kodira lig gen. DNK ligaza u E. coli, kao i većina prokariota, koristi energiju dobijenu cijepanjem nikotinamid adenin-dinukleotida (NAD) za stvaranje fosfodiesterske veze.[3] Ne vezuje DNK sa tupim krajevima osim u uslovima molekulske gužve sa polietilen-glikolom i ne može efikasno spojiti RNK sa DNK.

Aktivnost DNK ligaze E. coli može se poboljšati pomoću DNK-polimeraza u pravim koncentracijama. Poboljšanje djeluje samo kada su koncentracije DNK-polimeraze 1 mnogo niže od DNK fragmenata koji se povezuju. Kada su koncentracije Pol I DNK polimeraze veće, to ima negativan učinak na DNK ligazu E. coli[4]

T4

uredi

DNK ligaza iz bakteriofaga T4 (bakteriofaga koji inficira bakterije Escherichia coli). T4 ligaza se najčešće koristi u laboratorijskim istraživanjima.[5] Može da ligira ili kohezivni ili tupi kraj DNK, oligonukleotida, kao i RNK RNK–DNK hibrida, ali ne i jednolančane nukleinske kiseline. Također može da ligira DNK sa tupim krajevima sa mnogo većom efikasnošću od DNK ligaza E. coli. Za razliku od DNK ligaza E. coli, DNK ligaza T4 ne može iskoristiti NAD i ima apsolutnu potrebu za ATP kao kofaktorom. Neko inženjerstvo je urađeno da bi se poboljšala in vitro aktivnost T4 DNK ligaze; jedan uspješan pristup, naprimjer, testirao je T4 DNK ligazu spojenu na nekoliko alternativnih proteina koji vežu DNK i otkrio da su konstrukti s p50 ili NF-kB kao fuzijskim partnerima bili preko 160% aktivniji u vezivanju tupih krajeva za kloniranje namjene od divljeg tipa DNK ligaze T4.[6] Tipska reakcija za insertiranje fragmenta u plazmidni vektor koristila bi oko 0,01 (ljepljivi krajevi) do 1 (tupi krajevi) jedinica ligaze. Optimalna temperatura inkubacije za DNK ligazu T4 je 16 °C.

Ligazni mutant bakteriofaga T4 ima povećanu osjetljivost na oba UV zračenja [7][8] i alkilirajući agens metil-metansulfonat[9] što ukazuje da se DNK ligaza koristi u popravkama oštećenja DNK uzrokovanih ovim agensima.

Sisarska

uredi

Kod sisara postoje četiri specifična tipa ligaze.

  1. DNK ligaza I: ligira nastajuću DNK zaostajućeg lanca nakon što je ribonukleaza H uklonila RNK prajmer iz Okazakijevih fragmenata.
  2. DNK ligaza III: kompleksi sa proteinom popravka DNK XRCC1 za pomoć u zatvaranju DNK tokom procesa popravka ekscizije nukleotida i rekombinantnih fragmenata. Od svih poznatih DNK ligaza sisara, otkriveno je da je samo Lig III, prisutna u mitohondrijama.
  3. DNK ligaza IV: kompleksi sa XRCC4. On katalizira posljednji korak u spajanju nehomolognog kraja, putu popravke dvolančanog prekida DNK. Takođe je potreban za V(D)J rekombinaciju, proces koji generira raznolikost u imunoglobulinu i lokusima T-ćelijskih receptora tokom razvoja imunskog sistema.
  • DNK ligaza II: Artefakt prečišćavanja koji je rezultat proteolitske degradacije DNK ligaze III. U početku je prepoznata kao druga DNK ligaza i to je razlog neobične nomenklature DNK ligaza.[10]

DNK ligaza iz eukariota i nekih mikroba koristi adenozin-trifosfat (ATP) umjesto NAD.[3]

Termostabilnost

uredi

Izveden iz termofilne bakterije, enzim je stabilan i aktivan na mnogo višim temperaturama od konvencijskih DNK ligaza. Poluživot mu je 48 sati na 65 °C i više od 1 sat na 95 °C. Pokazalo se da je ampligaza DNK ligaza aktivna za najmanje 500 termičkih ciklusa (94 °C/80 °C) ili 16 sati ciklusa.10  Ova izuzetna termostabilnost omogućava izuzetno visoku hibridizaciju i specifičnost ligacije.[11]

Također pogledajte

uredi

Reference

uredi
  1. ^ Pascal JM, O'Brien PJ, Tomkinson AE, Ellenberger T (novembar 2004). "Human DNA ligase I completely encircles and partially unwinds nicked DNA". Nature. 432 (7016): 473–8. Bibcode:2004Natur.432..473P. doi:10.1038/nature03082. PMID 15565146. S2CID 3105417.
  2. ^ Lehman IR (novembar 1974). "DNA ligase: structure, mechanism, and function". Science. 186 (4166): 790–7. Bibcode:1974Sci...186..790L. doi:10.1126/science.186.4166.790. PMID 4377758. S2CID 86549159.
  3. ^ a b Foster JB, Slonczewski J (2010). Microbiology: An Evolving Science (Second izd.). New York: W. W. Norton & Company. ISBN 978-0-393-93447-2.
  4. ^ Yang Y, LiCata VJ (februar 2018). "Pol I DNA polymerases stimulate DNA end-joining by Escherichia coli DNA ligase". Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (1): 13–18. doi:10.1016/j.bbrc.2018.01.165. PMID 29409896.
  5. ^ "Ligases" (PDF). Enzyme Resources Guide. Promega Corporation. str. 8–14.
  6. ^ Wilson RH, Morton SK, Deiderick H, Gerth ML, Paul HA, Gerber I, Patel A, Ellington AD, Hunicke-Smith SP, Patrick WM (juli 2013). "Engineered DNA ligases with improved activities in vitro". Protein Engineering, Design & Selection. 26 (7): 471–8. doi:10.1093/protein/gzt024. PMID 23754529.
  7. ^ Baldy MW (1968). "Repair and recombination in phage T4. II. Genes affecting UV sensitivity". Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 33: 333–8. doi:10.1101/sqb.1968.033.01.038. PMID 4891973.
  8. ^ Baldy MW (februar 1970). "The UV sensitivity of some early-function temperature-sensitive mutants of phage T4". Virology. 40 (2): 272–87. doi:10.1016/0042-6822(70)90403-4. PMID 4909413.
  9. ^ Baldy MW, Strom B, Bernstein H (mart 1971). "Repair of alkylated bacteriophage T4 deoxyribonucleic acid by a mechanism involving polynucleotide ligase". Journal of Virology. 7 (3): 407–8. doi:10.1128/JVI.7.3.407-408.1971. PMC 356131. PMID 4927528.
  10. ^ Tomkinson, Alan E; Sallmyr, Annahita (5. 9. 2013). "Structure and function of the DNA ligases encoded by the mammalian LIG3 gene". Gene. 531 (2): 150–157. doi:10.1016/j.gene.2013.08.061. PMC 3881560. PMID 24013086.
  11. ^ "Ampligase- Thermostable DNA Ligase". www.epibio.com. Arhivirano s originala, 19. 6. 2017. Pristupljeno 15. 5. 2017.

Vanjski linkovi

uredi


 Portal Biologija
Preuzeto iz "https://bs.wikipedia.org/w/index.php?title=DNK-ligaza&oldid=3481681"