DNK-krajevi

DNK krajevi odnose se na svojstva krajeva linearnih molekula DNK, koji su u molekulskoj biologiji opisani kao "ljepljivi" ili "tupi", na osnovu oblika komplementarnih lanaca na terminusu. U ljepljivim krajevima, jedan lanac je duži od drugog (obično za najmanje nekoliko nukleotida), tako da duži lanac ima baze koje su ostale nesparene. U tupim krajevima, oba polulanca su jednake dužine – tj. završavaju se na istom osnovnom položaju, ne ostavljajući neuparene osnove ni na jednoj niti.

Krajevi molekule DNK

HindIII Vektor mjesta ograničenja i ljepljivih krajeva

Ligacija s tupim krajevima

Koncept se koristi u molekulskoj biologiji, u kloniranju ili kada se subklonira umetnuta DNK u vektorska DNK. Takve krajeve mogu generirati restrikcijski enzimi koji razbijaju fosfodiestersku kičmu molekula na određenim lokacijama, koje same po sebi pripadaju većoj klasi enzima zvanim egzonukleaze i endonukleaze. Restrikcijski enzim koji cijepa okosnicu oba lanca na nesusjednim lokacijama ostavlja poprečni rez, stvarajući dva ljepljiva kraja koji se preklapaju, dok enzim koji pravi ravan rez (na lokacijama direktno jedan preko drugog na oba polulanca) stvara dva tupa kraja.

Jednolančane molekule DNK

Jednolančana nekružna DNK molekula ima dva neidentična kraja, 3' kraj i 5' kraj (obično se izgovara kao "tri prim kraj" i "pet prim kraj") . Brojevi se odnose na numerisanje atoma ugljika u dezoksiribozi, šećeru koji čini važan dio okosnice molekula DNK. U kičmi DNK, 5' ugljik jedne dezoksiriboze povezan je sa 3' ugljikom druge vezom fosfodiestarske veze. 5' ugljik ove dezoksiriboze je ponovo povezan sa 3' ugljikom sljedeće, i tako dalje.

Varijacije dvolančanih molekula

Kada je molekula DNK dvolančana, kao što je DNK obično, dva lanca se kreću u suprotnim smjerovima. Stoga će jedan kraj molekula imati 3' kraj lanca 1 i 5' kraj lanca 2, i obrnuto na drugom kraju. Međutim, činjenica da je dvolančana molekula dopušta brojne različite varijacije.

Tupi krajevi

Najjednostavniji kraj DNK dvolančane molekule naziva se "tupi kraj". Tupi krajevi su također poznati kao nekohezivni krajevi. U molekuli sa tupim krajem, oba lanca završavaju u baznom paru. Tupi krajevi nisu uvijek poželjni u biotehnologiji jer kada se koristi DNK-ligaza za spajanje dviju molekula u jednu, prinos je znatno manji kod tupih krajeva. Prilikom izvođenja subkloniranja, ono također ima nedostatak potencijalne insercije DNK umetanja u suprotnoj željenoj orijentaciji. S druge strane, tupi krajevi su uvijek međusobno kompatibilni. Evo primjera malog komada DNK sa tupim krajevima:

5'-GATCTGACTGATGCGTATGCTAGT-3'

3'-CTAGACTGACTACGCATACGATCA-5'

Prevjesi i ljepljivi krajevi

Netupi krajevi nastaju raznim „prevjesima“. Prevjes je dio nesparenih nukleotida na kraju molekula DNK. Ovi nespareni nukleotidi mogu biti u bilo kojoj niti, stvarajući ili 3' ili 5' previse. Ovi prepusti su u većini slučajeva palindromski.

Najjednostavniji slučaj prevjesa je jedan nukleotid. Ovo je najčešće adenin i stvara se kao 3' previs od strane nekih DNK-polimeraza. Ovo se najčešće koristi u kloniranju PCR proizvoda stvorenih takvim enzimom. Proizvod je spojen sa linearnom DNK molekulom sa 3' timinskim prepustom. Pošto adenin i timin formiraju bazni par, to olakšava spajanje dvije molekule pomoću ligaze, čime se dobija kružni molekul. Evo primjera A-prepusta:

5'-ATCTGACTA-3'

3'-TAGACTGA -5'

Duži prepusti se nazivaju kohezivni krajevi ili ljepljivi krajevi. Najčešće ih stvaraju restrikcijske endonukleaze kada presjeku DNK. Vrlo često odsjeku dva lanca DNK četiri para baza jedan od drugog, stvarajući četverobazni 3' prevjes u jednoj molekuli i komplementarni 3' prevjes u drugom. Ovi krajevi se nazivaju kohezivni jer se lahko spajaju ligazom.

Naprimjer, ova dva "ljepljiva" kraja su kompatibilna:

5'-ATCTGACT GATGCGTATGCT-3'

3'-TAGACTGACTACG CATACGA-5'

Također, budući da različite restrikcijske endonukleaze obično stvaraju različite prevjese, moguće je stvoriti plazmid, izrezivanjem dijela DNK (koristeći različite enzime za svaki kraj) i zatim ga spojiti s drugom molekulom DNK sa krajevima obrubljenim istim enzimima. Budući da prevjesi moraju biti komplementarni da bi ligaza funkcionirala, dvije molekule mogu se spojiti samo u jednoj orijentaciji. Ovo je često veoma poželjno u molekulskoj biologiji.

Izlizani krajevi

Preko svakog pojedinačnog lanca DNK, obično vidimo adenin uparen sa timinom, a citozin sa guaninom, kako bi se formirao paralelni komplementarni lanac kao što je opisano u nastavku. Dvije nukleotidne sekvence koje odgovaraju jedna drugoj na ovaj način nazivaju se komplementarne:

5'-ATCTGACT-3'

3'-TAGACTGA-5'

Izlizani kraj se odnosi na regiju dvolančane (ili druge višelančane) DNK molekule blizu kraja sa značajnim udjelom nekomplementarnih sekvenci; to jest sekvenca u kojoj se nukleotidi na susjednim lancima ne poklapaju ispravno::

5'-ATCTGACTAGGCA-3'

3'-TAGACTGACTACG-5'

Termin "izlizan" koristi se zato što pogrešno usklađeni nukleotidi imaju tendenciju da izbjegnu vezivanje, tako da izgledaju slično nitima u komadu užeta koje se izlizalo.

Iako su nekomplementarne sekvence moguće i u sredini dvolančane DNK, neusklađeni regioni udaljeni od krajeva se ne nazivaju "pohabanim"/izlizanim/istrođenim.

Otkriće

Ronald W. Davis je prvi otkrio ljepljive krajeve, kao proizvod djelovanja EcoRI, restrikcije endonukleaze.

Snaga

Lepljive krajnje karike razlikuju se po svojoj stabilnosti. Slobodna energija formiranja može se izmjeriti da bi se procijenila stabilnost. Aproksimacije slobodne energije mogu se napraviti za različite sekvence iz podataka koji se odnose na krivulje termalne denaturacije oligonukleotida UV. Također predviđanja iz simulacija molekulske dinamike pokazuju da su neke ljepljive krajnje karike mnogo jače rastezane od drugih.

Reference

• Sambrook, Joseph; David Russell (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0879695765.