Vektor (genetika)

U molekulskom kloniranju, vektor je svaka čestica (npr. plazmidi, kozmidi, lambda fagi) koja se koristi kao sredstvo za vještački unos stranu nukleinske sekvence – obično DNK – u drugu ćeliju, gdje se može replicirati i/ili eksprimirati.^[1] Vektor koji sadrži stranu DNK naziva se rekombinantna DNK. Četiri glavna tipa vektora su plazmidi, virusni vektori, kozmidi, i vještački hromosomi. Od njih, najčešće korišćeni vektori su plazmidi.^[2] Zajedničko svim projektovanim vektorima je da imaju porijeklo replikacije, mjesto višestrukog kloniranja i marker koji se može birati.

Sam vektor općenito nosi sekvencu DNK koja se sastoji od inserta (u ovom slučaju transgena) i veće sekvence koja služi kao "kičmmeni" vektor. Svrha vektora koji prenosi genetičke informacije u drugu ćeliju je tipično da izoluje, umnožava ili eksprimira insert u ciljnoj ćeliji. Svi vektori se mogu koristiti za kloniranje i stoga su vektor za kloniranje, ali postoje i vektori dizajnirani posebno za kloniranje, dok drugi mogu biti dizajnirani posebno za druge svrhe, kao što su transkripcija i ekspresija proteina. Vektori dizajnirani posebno za ekspresiju transgena u ciljnoj ćeliji nazivaju se ekspresijski vektor i općenito imaju promotorsku sekvencu koja pokreće ekspresiju transgena. Jednostavniji vektori koji se nazivaju transkripcijski vektori mogu se samo transkribovati, ali ne i prevesti: mogu se replicirati u ciljnoj ćeliji, ali ne i eksprimirati, za razliku od ekspresijskih vektora. Transkripcijski vektori se koriste za amplifikaciju njihovog inserta.

Manipulacija DNK se obično izvodi na E. coli vektora, koji sadrže elemente neophodne za njihovo održavanje u E. coli. Međutim, vektori mogu imati i elemente koji im omogućavaju da se održe u drugom organizmu kao što su ćelije kvasca, biljaka ili sisara, a ovi vektori se nazivaju šatl vektori. Takvi vektori imaju bakterijske ili virusne elemente koji se mogu prenijeti na nebakterijski organizam domaćina, ali razvijeni su i drugi vektori koji se nazivaju intragenski vektori kako bi se izbjegao prijenos bilo kojeg genetičkog materijala sa strane vrste.^[3]

Insercija vektora u ciljnu ćeliju obično se naziva transformacija za bakterijske ćelije,^[4] transfekcija za eukariotske ćelije,^[5] iako se umetanje virusnog vektora često naziva transdukcija.^[6]

Karakteristike

Plazmidi

Plazmidi su dvolančane vanhromosomske i općenito kružne sekvence DNK koje su sposobne za replikaciju pomoću mehanizma za replikaciju ćelije domaćina.^[7] Plazmidni vektori minimalistički se sastoje od početka replikacije koji omogućava polunezavisnu replikaciju plazmida u domaćinu. Plazmidi se široko nalaze u mnogim bakterijama, naprimjer u Escherichia coli, ali se mogu naći i u nekoliko eukariota, naprimjer u kvascima, kao npr. u Saccharomyces cerevisiae.^[8] Bakterijski plazmidi mogu biti konjugativni/prenosivi i nekonjugativni:

konjugativni – posreduju u prijenosu DNK konjugacijom i stoga se brzo šire među bakterijskim ćelijama populacije; npr. F-plazmid, mnogi R i neki col plazmidi.
nekonjugativno – ne posreduju u DNK konjugacijom, npr. mnogim R i col plazmidi.

Plazmid pBR322 je jedan od prvih plazmida koji se široko koristi kao vektor za kloniranje.

Plazmidi sa posebno konstruisanim karakteristikama se obično koriste u laboratoriji za svrhe kloniranja. Ovi plazmidi općenito nisu konjugativni, ali mogu imati mnogo više karakteristika, posebno "mjesto višestrukog kloniranja", gdje višestruka mjesta cijepanja restrikcijskim enzimom dozvoljavaju umetanje transgenskog inserta. Bakterije koje sadrže plazmide mogu generirati milione kopija vektora unutar bakterija za nekoliko sati, a pojačani vektori se mogu ekstrahirati iz bakterija za dalju manipulaciju. Plazmidi se mogu koristiti posebno kao vektori za transkripciju i takvim plazmidima mogu nedostajati ključne sekvence za ekspresiju proteina. Plazmidi koji se koriste za ekspresiju proteina, zvani ekspresijski vektori, bi uključivali elemente za translaciju proteina, kao što su ribosomsko vezno mjesto, startni i stop kodoni .

Virusni vektori

Virusni vektori su genetički modifikovani virusi koji nose modifikovanu virusnu DNK ili RNK koja je postala neinfektivna, ali i dalje sadrže virusne promotore, kao i transgen, što omogućava transgenu transgena kroz virusni promotor. Međutim, budući da virusnim vektorima često nedostaju infektivne sekvence, oni zahtijevaju pomoćne viruse ili linije za pakovanje za transfekciju velikih razmjera. Virusni vektori su često dizajnirani za trajnu inkorporaciju inserta u genom domaćina i tako ostavljaju različite genetičke marketre u genomu domaćina nakon ugradnje transgena. Naprimjer, retrovirusi ostavljaju karakterističan obrazac zvani retrovirusna integracija nakon umetanja koji se može detektirati i ukazuje da se virusni vektor ugradio u genom domaćina.

Veštački hromosomi

Vještački hromosomi su proizvedeni hromosomi u kontekstu vještačkog kvaščevog hromosoma (YAC), bakterijskog vještakog hromosoma (BAC) ili ljudskog vještačkog hromosoma (HAC). Vještački hromosom može nositi mnogo veći fragment DNK od drugih vektora.^[9] YAC i BAC mogu nositi fragment DNK dug do 300.000 nukleotida. Tri strukturne potrebe za vještačkim hromosomom uključuju porijeklo replikacije, centromere i telomerne krajnje sekvence.^[10]

Transkripcija

Transkripcija kloniranog gena je neophodna komponenta vektora kada je potrebna ekspresija gena: jedan gen se može pojačati transkripcijom, kako bi se stvorile više kopija iRNK, šablona na kojima se protein može proizvesti translacijom.^[11] Veći broj iRNK bi eksprimirao veću količinu proteina, a koliko će se kopija iRNK generirati ovisi o promotoru koji se koristi u vektoru.^[12] Ekspresija može biti konstitutivna, što znači da se protein konstantno proizvodi u pozadini, ili može biti inducibilna pri čemu se protein eksprimira samo pod određenim uslovima, naprimjer kada se doda hemijski induktor. Ova dva različita tipa ekspresije zavise od tipa promotora i operatora koji se koristi.

Virusni promotori se često koriste za konstitutivnu ekspresiju u plazmidima i virusnim vektorima jer normalno podstiču konstantnu transkripciju u mnogim ćelijskim linijama i tipovima.^[13] Inducibilna ekspresija zavisi od promotora koji reaguju na uslove indukcije: naprimer, promotor virusa tumora mišje mliječne žlezde samo pokreće transkripciju nakon primjene deksametazona i promotor toplotnog šoka u rodu "Drosophila" počinje tek nakon visokih temperatura.

Neki vektori su dizajnirani samo za transkripciju, naprimjer za in vitro proizvodnju iRNK. Ovi vektori se nazivaju transkripcijski vektori. Možda im nedostaju sekvence neophodne za poliadenilaciju i terminaciju, stoga se ne mogu koristiti za proizvodnju proteina.

Ekspresija

Ekspresijski vektori proizvode proteine kroz transkripciju inserta vektora nakon čega slijedi translacija proizvedene iRNK; stoga im je potrebno više komponenti od jednostavnijih vektora samo za transkripciju. Ekspresija u različitim organizmima domaćinima zahtijevala bi različite elemente, iako dijele slične zahtjeve, naprimjer promotor za inicijaciju transkripcije, ribosomsko vezivno mjesto za inicijaciju translacije i signale terminacije.

Prokariotski vektor ekspresije

Promotor – najčešće korišteni inducibilni promotori su promotori izvedeni iz promotora lac operona i T7. Ostali jaki promotori koji se koriste uključuju Trp promotor i Tac-promotor, koji su hibrid i promotora Trp i Lac operona.
Ribosomsko mjesto vezivanja (RBS) – prati promotora i promovirta efikasno prevođenje proteina od interesa.
Mjesto inicijacije translacije – Shine-Dalgarno sekvenca zatvorena u RBS, 8 parova baza uzvodno od AUG startnog kodona.

Eukariotski vektor ekspresije

Ekspresijski vektori eukariota zahtijevaju sekvence koje kodiraju za:

Poliadenilacioni rep: Stvara poliadenilacioni rep na kraju transkribovane pre-mRNK koji štiti mRNA od egzonukleaze i obezbeđuje transkripcionu i translacionu terminaciju: stabilizuje proizvodnju mRNK.
Minimalna UTR dužina: UTR-ovi sadrže specifične karakteristike koje mogu ometati transkripciju ili translaciju, pa se stoga najkraći UTR-ovi ili uopće ne kodiraju u optimalnim ekspresijskim vektorima.
Kozak sekvenca: Vektori bi trebali kodirati Kozak sekvencu u mRNA, koja sastavlja ribozom za translaciju mRNA.

Karakteristike

Moderni umjetno konstruirani vektori sadrže bitne komponente koje se nalaze u svim vektorima, a mogu sadržavati i druge dodatne karakteristike koje se nalaze samo u nekim vektorima:

Porijeklo replikacije: Neophodno za replikaciju i održavanje vektora u ćeliji domaćinu.
Promotor: Promotori se koriste za pokretanje transkripcije transgena vektora, kao i drugih gena u vektoru, kao što je gen otpornosti na antibiotike. Neki vektori za kloniranje ne moraju imati promotor za klonirani umetak, ali on je bitna komponenta ekspresionih vektora tako da klonirani proizvod može biti eksprimiran.
Mjesto kloniranja: Ovo može biti mjesto višestrukog kloniranja ili druge karakteristike koje omogućavaju umetanje strane DNK u vektor putem ligacija.
Genetički markeri: Genetički markeri za virusne vektore omogućavaju potvrdu da se vektor integrisao sa genomskom DNK domaćina.
Rezistencija na antibiotike: Vektori sa otpornošću na antibiotike otvoreni okvir čitanja omogućavaju preživljavanje ćelija koje su preuzele vektor u medijumu za rast koji sadrži antibiotike kroz selekciju antibiotika.
Epitop: Neki vektori mogu sadržavati sekvencu za određeni epitop koji se može ugraditi u eksprimirani protein. Omogućava identifikaciju antitijela ćelija koje eksprimiraju ciljni protein.
Reporter geni: Neki vektori mogu sadržavati reporterski gen koji omogućava identifikaciju plazmida koji sadrži umetnutu DNK sekvencu. Primjer je lacZ-α koji kodira za fragment N-kraja β-galaktozidaze, enzima koji razgrađuje galaktozu. Višestruko mjesto kloniranja nalazi se unutar lacZ-α, a insert koji je uspješno ligiran u vektor će poremetiti sekvencu gena, što će rezultirati neaktivnom β-galaktozidazom. Ćelije koje sadrže vektor sa umetkom mogu se identifikovati korišćenjem plavo/bijela selekcija uzgojem ćelija u medijumu koji sadrži analog galaktoze (X-gal). Ćelije koje eksprimiraju β-galaktozidazu (dakle ne sadrže umetak) pojavljuju se kao plave kolonije. Bijele kolonije bi bile odabrane kao one koje mogu sadržavati umetak. Drugi često korišteni reporter uključuju zeleni fluorescentni protein i luciferaza.
Ciljna sekvenca: Ekspresioni vektori mogu uključivati kodiranje za ciljanu sekvencu u gotovom proteinu koja usmjerava eksprimirani protein na određenu organelu u ćeliji ili na određenu lokaciju kao što je periplazmatski prostor bakterija.
Oznake za pročišćavanje proteina: Neki ekspresioni vektori uključuju proteine ili peptidne sekvence koje omogućavaju lakše prečišćavanje eksprimiranog proteina. Primjeri uključuju polihistidinsku oznaku, glutation-S-transferazu i protein koji vezuje maltozu. Neke od ovih oznaka mogu takođe omogućiti povećanu rastvorljivost ciljnog proteina. Ciljni protein je fuzionisan za proteinsku oznaku, ali mjesto cijepanja proteaze smješteno u polipeptidnom linker regiji između proteina i oznake omogućava da se oznaka kasnije ukloni.

Također pogledajte

Plazmid
Virusni vektor
Vektor kloniranja
Vektor ekspresije
Hibridni vektor
Minikrug
Rekombinantna DNK
Gola DNK
Vektor (epidemiologija), organizam koji prenosi bolest
Ljudski veštački hromosomi
Vještački kvaščev hromosom
Bakterijski vještački hromozomi
DNK vakcinacija

Reference

^ "Vector". Genome.gov. Pristupljeno 16. 4. 2022.
^ Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J (2000). "DNA Cloning with Plasmid Vectors". Molecular Cell Biology (4th izd.). New York: W. H. Freeman.
^ Acquaah G (16. 8. 2012). Principles of Plant Genetics and Breeding. John Wiley & Sons Inc. ISBN 978-1-118-31369-5.
^ Johnston C, Martin B, Fichant G, Polard P, Claverys JP (mart 2014). "Bacterial transformation: distribution, shared mechanisms and divergent control". Nature Reviews. Microbiology. 12 (3): 181–96. doi:10.1038/nrmicro3199. PMID 24509783. S2CID 23559881.
^ "MeSH Browser". meshb.nlm.nih.gov (jezik: engleski). Pristupljeno 16. 4. 2018.
^ Hartl DL, Jones EW (1998). Genetics: principles and analysis (4th izd.). Sudbury, Mass.: Jones and Bartlett Publishers. ISBN 978-0-7637-0489-6. OCLC 45730915.
^ del Solar, Gloria; Giraldo, Rafael; Ruiz-Echevarría, María Jesús; Espinosa, Manuel; Díaz-Orejas, Ramón (juni 1998). "Replication and Control of Circular Bacterial Plasmids". Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (2): 434–464. doi:10.1128/MMBR.62.2.434-464.1998. ISSN 1092-2172. PMC 98921. PMID 9618448.
^ Brown TA (2010). "Chapter 2 - Vectors for Gene Cloning: Plasmids and Bacteriophages". Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction (6th izd.). Wiley-Blackwell. ISBN 978-1-4051-8173-0.
^ Julin, Douglas (2014). "Artificial Chromosomes". Molecular Life Sciences (jezik: engleski). Springer, New York, NY. str. 1–3. doi:10.1007/978-1-4614-6436-5_91-3. ISBN 978-1-4614-6436-5.
^ Murray, Andrew; Szostak, Jack (novembar 1987). "Artificial Chromosomes". Scientific American. 257 (5): 62–68. Bibcode:1987SciAm.257e..62M. doi:10.1038/scientificamerican1187-62. PMID 3317814.
^ Solomon EP, Berg LR, Martin DW (2005). Biology (8th izd.). Belmont, CA: Brooks/Cole Thomson Learning. ISBN 978-0-495-31714-2. OCLC 123008833.
^ Damdindorj L, Karnan S, Ota A, Hossain E, Konishi Y, Hosokawa Y, Konishi H (29. 8. 2014). "A comparative analysis of constitutive promoters located in adeno-associated viral vectors". PLOS ONE. 9 (8): e106472. Bibcode:2014PLoSO...9j6472D. doi:10.1371/journal.pone.0106472. PMC 4149579. PMID 25170953.
^ Lewin A, Mayer M, Chusainow J, Jacob D, Appel B (juni 2005). "Viral promoters can initiate expression of toxin genes introduced into Escherichia coli". BMC Biotechnology. 5: 19. doi:10.1186/1472-6750-5-19. PMC 1181807. PMID 15967027.

Dopunska literatura

Freshney IR (29. 7. 2005). Culture of Animal Cells: A manual of basic technique. Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons, Inc. ISBN 978-0-471-45329-1.

Vanjski linkovi

Waksman Scholars introduction to vectors Arhivirano 18. 1. 2008. na Wayback Machine
A comparison of vectors in use for clinical gene transfer Arhivirano 24. 5. 2011. na Wayback Machine
Gene Transport Unit Arhivirano 6. 12. 2007. na Wayback Machine

Portal Biologija

[Genome.gov-1] "Vector". Genome.gov. Pristupljeno 16. 4. 2022.

[2] Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J (2000). "DNA Cloning with Plasmid Vectors". Molecular Cell Biology (4th izd.). New York: W. H. Freeman.

[3] Acquaah G (16. 8. 2012). Principles of Plant Genetics and Breeding. John Wiley & Sons Inc. ISBN 978-1-118-31369-5.

[4] Johnston C, Martin B, Fichant G, Polard P, Claverys JP (mart 2014). "Bacterial transformation: distribution, shared mechanisms and divergent control". Nature Reviews. Microbiology. 12 (3): 181–96. doi:10.1038/nrmicro3199. PMID 24509783. S2CID 23559881.

[5] "MeSH Browser". meshb.nlm.nih.gov (jezik: engleski). Pristupljeno 16. 4. 2018.

[6] Hartl DL, Jones EW (1998). Genetics: principles and analysis (4th izd.). Sudbury, Mass.: Jones and Bartlett Publishers. ISBN 978-0-7637-0489-6. OCLC 45730915.

[7] Solar, Gloria; Giraldo, Rafael; Ruiz-Echevarría, María Jesús; Espinosa, Manuel; Díaz-Orejas, Ramón (juni 1998). "Replication and Control of Circular Bacterial Plasmids". Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (2): 434–464. doi:10.1128/MMBR.62.2.434-464.1998. ISSN 1092-2172. PMC 98921. PMID 9618448.

[8] Brown TA (2010). "Chapter 2 - Vectors for Gene Cloning: Plasmids and Bacteriophages". Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction (6th izd.). Wiley-Blackwell. ISBN 978-1-4051-8173-0.

[9] Julin, Douglas (2014). "Artificial Chromosomes". Molecular Life Sciences (jezik: engleski). Springer, New York, NY. str. 1–3. doi:10.1007/978-1-4614-6436-5_91-3. ISBN 978-1-4614-6436-5.

[10] Murray, Andrew; Szostak, Jack (novembar 1987). "Artificial Chromosomes". Scientific American. 257 (5): 62–68. Bibcode:1987SciAm.257e..62M. doi:10.1038/scientificamerican1187-62. PMID 3317814.

[11] Solomon EP, Berg LR, Martin DW (2005). Biology (8th izd.). Belmont, CA: Brooks/Cole Thomson Learning. ISBN 978-0-495-31714-2. OCLC 123008833.

[12] Damdindorj L, Karnan S, Ota A, Hossain E, Konishi Y, Hosokawa Y, Konishi H (29. 8. 2014). "A comparative analysis of constitutive promoters located in adeno-associated viral vectors". PLOS ONE. 9 (8): e106472. Bibcode:2014PLoSO...9j6472D. doi:10.1371/journal.pone.0106472. PMC 4149579. PMID 25170953.

[13] Lewin A, Mayer M, Chusainow J, Jacob D, Appel B (juni 2005). "Viral promoters can initiate expression of toxin genes introduced into Escherichia coli". BMC Biotechnology. 5: 19. doi:10.1186/1472-6750-5-19. PMC 1181807. PMID 15967027.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]