Prečišćavanje proteina

Prečišćavanje proteina je niz procesa namijenjenih za izolaciju jednog ili nekoliko proteina iz složene smjese, obično ćelije, tkiva ili cijelih organizama. Prečišćavanje proteina je od vitalnog značaja za specifikaciju funkcije, strukture i interakcija proteina od interesa. Proces prečišćavanja može odvojiti proteinske i neproteinske dijelove mješavine i konačno odvojiti željeni protein od svih ostalih proteina. U idealnom slučaju, da bi se proučavao protein od interesa, on mora biti odvojen od ostalih komponenti ćelije, tako da kontaminanti ne ometaju ispitivanje strukture i funkcije proteina od interesa.^[1] Separacija jednog proteina od svih ostalih je obično najzahtjevniji aspekt prečišćavanja proteina. Koraci razdvajanja obično koriste razlike u veličini proteina, fizičko-hemijskim svojstvima, afinitetu vezivanja i biološkoj aktivnosti. Čisti rezultat se može nazvati proteinski izolat.

Svrha uredi

Troškovi proizvodnje proteina ostaju visoki i postoji rastuća potražnja za razvojem ekonomičnih i brzih metoda prečišćavanja proteina. Razumijevanje različitih metoda pročišćavanja proteina i optimizacija daljnje obrade su od ključne važnosti za minimiziranje troškova proizvodnje uz održavanje kvaliteta prihvatljivih standarda homogenosti.^[2] Prečišćavanje proteina je ili preparativno ili analitičko. Preparativna prečišćavanja imaju za cilj proizvodnju relativno velike količine prečišćenih proteina za naknadnu upotrebu. Primjeri uključuju pripremu komercijalnih proizvoda kao što su enzimii (npr. laktaza), nutritivni proteini (npr. sojin proteinski izolat) i određeni biofarmaceutski (npr. [[insulin]) ]). Često se koristi nekoliko koraka pripremnog prečišćavanja, kako bi se uklonili nusproizvodi, kao što su proteini ćelije domaćina, koji predstavljaju potencijalnu prijetnju zdravlju pacijenta.^[3] Analitičko prečišćavanje proizvodi relativno malu količinu proteina za različite istraživačke ili analitičke svrhe, uključujući identifikaciju, kvantifikaciju i proučavanje strukture proteina, posttranslacijske modifikacije i funkcije. Svaki korak procedure prečišćavanja proteina se prati i uzima u obzir nivoe prečišćavanja i prinos. Visok nivo prečišćavanja i slab prinos ne ostavljaju gotovo nikakav protein sa kojim bi se eksperimentisalo. S druge strane, visok prinos sa niskim nivoom prečišćavanja ostavlja mnogo zagađivača (proteina koji nije onaj koji je interesantan) koji ometa istraživačke svrhe.^[1]

Rekombinantne bakterije se mogu uzgajati u tikvici koja sadrži medij za rast.

Preliminarni koraci uredi

Ekstrakcija uredi

Ekstrakcija proteina iz hloroplasta

Ako organizam ne izlučuje protein od interesa u okolni rastvor, prvi korak svakog procesa pročišćavanja je razbijanje ćelijaa koje sadrže protein. Ovisno o tome koliko je protein krhak i koliko su ćelije stabilne, može se, naprimjer, koristiti jedan od sljedećih metoda: 1) ponovljeno zamrzavanje i odmrzavanje, 2) sonifikacija, 3) homogenizacija pod visokim pritiskom (Francuska presa), 4) homogenizacija mljevenjem (mlin za perle) i 5) permeabilizacija pomoću deterdženata (npr. Triton X-100) i/ili enzima (npr. lizozim ).^[4] Konačno, ćelijski ostaci se mogu ukloniti diferencijalnim centrifugiranjem, što je postupak u kojem se homogenat centrifugira malom brzinom, a zatim opet većom silom kako bi se dobio pelet koji se sastoji od jezgara i supernatanta. Ovo daje nekoliko frakcija opadajuće gustine gdje se na jednu frakciju primjenjuju diskriminatornije tehnike pročišćavanja.^[1]

Također, tokom lize ćelije oslobađaju se proteaze, koje će početi varenje proteina u rastvoru. Ako je protein od interesa osjetljiv na proteolizu, preporučuje se da se nastavi brzo i da se ekstrakt drži na hladnom, kako bi se usporila probava. Alternativno, jedan ili više inhibitora proteaze se može dodati u pufer za lizu, neposredno prije prekida ćelije. Ponekad je potrebno dodati i DNAazu kako bi se smanjila viskoznost ćelijskog lizata, uzrokovana visokim sadržajem DNK.

Ultracentrifugiranje uredi

Centrifugiranje je proces koji koristi centrifugalnu silu za razdvajanje mješavina čestica različitih masa ili gustoće suspendiranih u tekućini. Kada se posuda (obično cijev ili boca) koja sadrži mješavinu proteina ili drugih čestica, kao što su bakterijske ćelije, rotira velikom brzinom, inercija svake čestice stvara silu u smjeru brzine čestice što je proporcionalno njegnoj masi. Tendencija date čestice da se kreće kroz tečnost zbog ove sile je nadoknađena otporom koji tečnost vrši na česticu. Neto efekat "okretanja" uzorka u centrifugi je da se masivne, male i guste čestice kreću prema van brže od manje masivnih čestica ili čestica sa većim "povlačenjem" u tečnosti. Kada se suspendirane čestica "okreću" u centrifugi, na dnu posude može se formirati "pelet" koji je obogaćen za najmasivnije čestice sa malim otporom u tečnosti.

Nezbijene čestice ostaju uglavnom u tekućini koja se naziva "supernatant" i mogu se ukloniti iz posude odvajajući tako supernatant od peleta. Brzina centrifugiranja određena je ugaonim ubrzanjem primijenjenim na uzorak, obično mjereno u poređenju sa g. Ako se uzorci centrifugiraju dovoljno dugo, čestice u posudi će postići ravnotežu u kojoj se čestice akumuliraju posebno na tački u posudi gdje je njihova gustoća plutanja uravnotežena sa centrifugalnom silom. Takvo "ravnotežno" centrifugiranje može omogućiti opsežno prečišćavanje date čestice.

Centrifugiranje sa saharoznim gradijentom — linearni gradijent koncentracije šećera (obično saharoze, glicerola ili medija za gradijent gustoće na bazi silicij-dioksida, poput perkola) se stvara u cijevi tako da je najveća koncentracija na dnu, a najniža na vrhu. Percoll je zaštitni znak u vlasništvu kompanija GE Healthcare. Uzorak proteina se zatim nanosi na vrh gradijenta i vrti velikom brzinom u ultracentrifugi. To uzrokuje da teške makromolekule migriraju prema dnu cijevi brže od lakšeg materijala. Tokom centrifugiranja u odsustvu saharoze, kako se čestice pomiču sve dalje i dalje od centra rotacije, one doživljavaju sve više i više centrifugalne sile (što se dalje kreću, to se brže kreću). Problem s ovim je što je korisni raspon razdvajanja unutar posude ograničen na mali vidljivi prozor. Dvostruko duže okretanje uzorka ne znači da će čestica od interesa otići dvostruko dalje, u stvari, ona će ići znatno dalje. Međutim, kada se proteini kreću kroz gradijent saharoze, nailaze na tečnost sve veće gustpće i viskoznosti. Pravilno dizajniran gradijent saharoze će se suprotstaviti rastućoj centrifugalnoj sili tako da se čestice kreću u bliskoj proporciji s vremenom koje su bile u centrifugalnom polju. Uzorci odvojeni ovim gradijentima nazivaju se centrifugiranjem "zonske brzine". Nakon odvajanja proteina/čestica, gradijent se zatim frakcionira i sakuplja. U biohemiji, ultracentrifugiranje je dragocjeno za odvajanje biomolekula i analizu njihovih fizičkih svojstava.^[1]

Strategije prečišćavanja uredi

Hromatografska oprema. Ovdje je postavljena hromatografija isključivanja veličine. Pufer se pumpa kroz kolonu (desno) pomoću kompjuterski kontrolisanog uređaja.

Izbor polaznog materijala je ključ za dizajn procesa prečišćavanja. U biljci ili životinji, određeni protein obično nije raspoređen homogeno u cijelom tijelu; različiti organi ili tkiva imaju veće ili niže koncentracije proteina. Upotreba samo tkiva ili organa s najvećom koncentracijom smanjuje volumene potrebne za proizvodnju određene količine prečišćenog proteina. Ako je protein prisutan u maloj količini ili ako ima visoku vrijednost, može koristiti tehnologija rekombinantne DNK da se razviju ćelije koje će proizvoditi velike količine željenog proteina (ovo je poznato kao ekspresijski sistem). Rekombinantna ekspresija omogućava da se protein označi, npr. za His-tag^[5] ili Strep-tag^[6] kako bi se olakšalo prečišćavanje, smanjujući broj potrebnih njegovih koraka.

Analitičko prečišćavanje općenito koristi tri svojstva za razdvajanje proteina.

Prvo, proteini se mogu pročistiti u skladu sa njihovim izoelektričnim tačkama, propuštanjem kroz gel s pH stepenom ili kolonu za ionsku izmjenu.
Drugo, proteini se mogu razdvojiti prema njihovoj veličini ili molekulskoj težini putem hromatografija isključivanja veličine ili analizom SDS-PAGE (natrij-dodecil sulfat-poliakrilamidna gel elektroforeza). Proteini se često prečišćavaju upotrebom 2D-PAGE, a zatim se analiziraju pomoću peptidne mase prstiju, kako bi se utvrdio identitet proteina. Ovo je vrlo korisno u naučne svrhe, a granice detekcije proteina su danas vrlo niske i nanogramske količine proteina su dovoljne za njihovu analizu.
Treće, proteini se mogu razdvojiti po polarnosti/hidrofobnosti putem tečne hromatografije visokih performansi ili hromatografija reverzne faze.

Obično protokol za prečišćavanje proteina sadrži jedan ili više hromatografskih koraka. Osnovni postupak u hromatografiji je protok rastvora koji sadrži protein kroz kolonu napunjenu različitim materijalima. Različiti proteini različito stupaju u interakciju sa materijalom kolone i stoga mogu biti razdvojeni vremenom potrebnim za prolazak kolone ili uslovima potrebnim za eluiranje proteina iz kolone. Proteini se obično detektuju dok izlaze iz kolone po njihovoj apsorpciji na 280 nm. Postoji mnogo različitih hromatografskih metoda:

Precipitacija i diferencijalna solubilizacija uredi

Postupak rečišćavanje proteina meta-vezanjem

Većina proteina zahteva malo soli da bi se rastvorila u vodi, proces koji se zove soljenje. Kako se koncentracija soli povećava, proteini se mogu taložiti, proces koji se naziva isoljavanje koji uključuje promenu rastvorljivosti proteina.^[1] Naprimer, u prečišćavanju rasutih proteina, uobičajen prvi korak za izolaciju proteina je precipitacija sa amonij-sulfatom (NH₄)₂SO ₄.^[7] Ovo se izvodi dodavanjem sve veće količine amonij-sulfata i prikupljanjem različitih frakcija precipitiranih proteina. Nakon toga, amonij-sulfat se može ukloniti pomoću dijalize (odvajanje proteina od malih molekula kroz polupropusnu membranu).^[1] Tokom koraka taloženja amonij-sulfata, hidrofobne grupe na proteinima izložene su atmosferi, privlačeći druge hidrofobne grupe; rezultat je stvaranje agregata hidrofobnih komponenti. U ovom slučaju, talog proteina će obično biti vidljiv golim okom. Jedna od prednosti ove metode je što se može izvesti jeftino, čak i sa vrlo velikim obima.

Prvi proteini koji se prečišćavaju su proteini rastvorljivi u vodi. Prečišćavanje proteina integralne membrane zahtijeva prekid ćelijske membrane. kako bi se izolovao bilo koji određeni protein od drugih koji se nalaze u istom membranskom odjeljku. Ponekad se određena frakcija membrane može prvo izolirati, kao što je izolacija mitohondrija iz ćelija prije prečišćavanja proteina koji se nalazi u mitohondrijskoj membrani. Deterdženti, kao što je natrij-dodecil sulfat (SDS) mogu se koristiti za rastvaranje ćelijskih membrana i zadržavanje membranskih proteina u rastvoru tokom prečišćavanja; međutim, pošto SDS uzrokuje denaturaciju, blaži deterdženti kao što su Triton X-100 ili CHAPS mogu se koristiti za zadržavanje prirodne konformacije proteina tokom potpunog prečišćavanja.

Isključivanje veličine (gel-filtracijska hromatografija) uredi

Hromatografija se može koristiti za odvajanje proteina u rastvoru ili uslovima denaturacije, korišćenjem poroznih gelova. Ova tehnika je diskriminatornije odvajanje i poznata je kao hromatografija isključenja veličine (Size Exclusion Chromatography). Princip je da manje molekule moraju proći kroz veći volumen u poroznoj matrici. Posljedično, proteini određenog raspona veličine će zahtijevati varijabilnu zapreminu eluenta (rastvarača) prije nego što se sakupe na drugom kraju kolone gela.

U kontekstu prečišćavanja proteina, eluent se obično skuplja u različite epruvete. Sve epruvete koje ne sadrže mjerljive tragove proteina za pročišćavanje se odbacuju. Preostali rastvor je tako napravljen od proteina za prečišćavanje i svih drugih proteina slične veličine.

Separacija na osnovu naelektrisanja (iono-izmjenjivačka hromatografija) uredi

Jedna tehnika hromatografije zasnovana na molekularnim svojstvima obično nije dovoljna za dobijanje proteina visoke čistoće.^[1] Pored veličine, ionoizmenjivačka hromatografija razdvaja spojeve prema prirodi i stepenu njihovog ionskog naboja. Kolona koja će se koristiti bira se prema njenom tipu i jačini punjenja. Anionske izmjenjivačke smole imaju pozitivan naboj i služe za zadržavanje i odvajanje negativno nabijenih spojeva (aniona), dok kationske izmjenjivačke smole imaju negativan naboj i služe za odvajanje pozitivno nabijenih molekula (kationa).

Prije nego što odvajanje počne, kroz kolonu se pumpa pufer, kako bi se uravnotežili suprotni nabijeni ioni. Nakon ubrizgavanja uzorka, molekule rastvorene tvari će se razmjenjivati s puferskim ionima jer se svaki takmiči za mjesto vezanja na smoli. Dužina zadržavanja za svaku rastvorenu tvar ovisi o jačini njenog naboja. Najslabije naelektrisani spojevi će prvo eluirati, a zatim slijede ona sa sukcesivno jačim nabojem. Zbog prirode mehanizma za odvajanje, pH, tip pufera, koncentracija pufera i temperatura igraju važnu ulogu u kontroli odvajanja.

Ionoizmjenjivačka hromatografija je vrlo moćan alat za korištenje u prečišćavanju proteina i često se koristi i u analitičkim i u preparativnim separacijama.

Nikl-afinitetna kolona. Smola je plava jer je vezala nikal.

Također pogledajte uredi

Reference uredi

^ ^a ^b ^c ^d ^e ^f ^g Berg, Jeremy M.; Tymoczko, John L.; Stryer, Lubert (2012). Biochemistry (7th izd.). New York: W. H. Freeman and Company. str. 69–70. ISBN 978-1-4292-2936-4.
^ Labrou, N. E. (2021). "Protein Purification Technologies". Methods in Molecular Biology. 2178: 3–10. doi:10.1007/978-1-0716-0775-6_1. ISBN 978-1-0716-0774-9. PMID 33128738. S2CID 226224596.
^ Wang X, Hunter AK, Mozier NM (juni 2009). "Host cell proteins in biologics development: Identification, quantitation and risk assessment". Biotechnology and Bioengineering. 103 (3): 446–58. doi:10.1002/bit.22304. PMID 19388135.
^ Scopes RK (1994). Protein Purification - Springer. doi:10.1007/978-1-4757-2333-5. ISBN 978-1-4419-2833-7.
^ Spriestersbach A, Kubicek J, Schäfer F, Block H, Maertens B (2015). "Purification of His-Tagged Proteins". Methods in Enzymology. Elsevier. 559: 1–15. doi:10.1016/bs.mie.2014.11.003. ISBN 978-0-12-800279-7. PMID 26096499.
^ Schmidt TG, Skerra A (2007). "The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins". Nature Protocols. 2 (6): 1528–35. doi:10.1038/nprot.2007.209. PMID 17571060. S2CID 25209313.
^ Wingfield P (maj 2001). "Protein precipitation using ammonium sulfate". Current Protocols in Protein Science. Appendix 3: A.3F.1–A.3F.8. doi:10.1002/0471140864.psa03fs13. ISBN 978-0-471-14086-3. PMC 4817497. PMID 18429073.

Vanjski linkovi uredi

Protein purification ebook
Protein purification facility
Strategies for Protein Purification Handbook Arhivirano 5. 12. 2008. na Wayback Machine

[Biochemistry69-1] ^ ^a ^b ^c ^d ^e ^f ^g Berg, Jeremy M.; Tymoczko, John L.; Stryer, Lubert (2012). Biochemistry (7th izd.). New York: W. H. Freeman and Company. str. 69–70. ISBN 978-1-4292-2936-4.

[2] Labrou, N. E. (2021). "Protein Purification Technologies". Methods in Molecular Biology. 2178: 3–10. doi:10.1007/978-1-0716-0775-6_1. ISBN 978-1-0716-0774-9. PMID 33128738. S2CID 226224596.

[3] Wang X, Hunter AK, Mozier NM (juni 2009). "Host cell proteins in biologics development: Identification, quantitation and risk assessment". Biotechnology and Bioengineering. 103 (3): 446–58. doi:10.1002/bit.22304. PMID 19388135.

[4] Scopes RK (1994). Protein Purification - Springer. doi:10.1007/978-1-4757-2333-5. ISBN 978-1-4419-2833-7.

[5] Spriestersbach A, Kubicek J, Schäfer F, Block H, Maertens B (2015). "Purification of His-Tagged Proteins". Methods in Enzymology. Elsevier. 559: 1–15. doi:10.1016/bs.mie.2014.11.003. ISBN 978-0-12-800279-7. PMID 26096499.

[6] Schmidt TG, Skerra A (2007). "The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins". Nature Protocols. 2 (6): 1528–35. doi:10.1038/nprot.2007.209. PMID 17571060. S2CID 25209313.

[7] Wingfield P (maj 2001). "Protein precipitation using ammonium sulfate". Current Protocols in Protein Science. Appendix 3: A.3F.1–A.3F.8. doi:10.1002/0471140864.psa03fs13. ISBN 978-0-471-14086-3. PMC 4817497. PMID 18429073.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]