HPLC

Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) je oblik kolonske hromatografije koji se često koristi u analitičkoj hemiji. Nekada se naziva i Tečna hromatografija pod visokim pritiskom. HPLC se koristi za razdvajanje komponenti iz smjese na osnovu hemijskih interakcija između supstance koja se analizira i stacionarne faze u koloni.

Shema uređaja za HPLC

Način rada

Princip rada HPLC-a je forsiranje prolaska analizirane supstance (ili smjese) kroz kolonu (cijev punjena materijalom sitnih čestica, a time i velike površine) pumpanjem tečnosti (mobilna faza) pod visokim pritiskom kroz kolonu. Unosi se mala zapremina uzorka u tok mobilne faze i na osnovu specifičnih hemijskih i fizičkih interakcija, dolazi do različitog zadržavanja komponenata smjese. Vrijeme zadržavanja zavisi od prirode supstance koja se analizira, stacionarne faze i sastava mobilne faze. Vrijeme za koje se supstanca eluira (dođe do kraja kolone) naziva se retenciono vrijeme i karakteristično je za određenu supstancu. Korištenje visokog pritiska povećava linearnu brzinu i daje komponentama manje vremena za zadržavanje, što poboljšava rezoluciju hromatograma. Koriste se uobičajeni rastavarači čisti ili u bilo kojoj kombinaciji (npr. voda, metanol, organski rastvarači...). Voda može sadržavati i neki pufer, kako bi se poboljšalo razdvajanje. Moguće je koristiti i gradijentno eluiranje, što podrazumijeva promjenu sastava mobilne faze u toku eluiranja.

Tipovi HPLC-a

Hromatografija na normalnim fazama

Ova metoda koristi polarnu stacionarnu fazu i nepolarnu mobilnu fazu, a koristi se kada je supstanca koja se analizira polarna. Polarna supstanca se adsorbira i zadržava na česticama stacionarne faze. Jačina adsorpcije je veća što je veća polarnost supstance, a samim time jeće i vrijeme zaržavanja. Korištenje polarnijih rastvarača u mobilnoj fazi smanjuje retenciono vrijeme. Ovaj tip hromatografije je napušten 1970-tih sa razvojem HPLC-a na obrnutim fazama, zbog slabe reproducibilnosti, uslijed promjena na česticama stacionarne faze pod uticajem rastvarača.

Hromatografija na obrnutim fazama

HPLC na obrnutim fazama (RP-HPLC) koristi nepolarnu stacionarnu fazu i polarnu mobilnu fazu. Najčešća stacionarna faza je silikatna, tretirana sa RMe₂SiCl, gdje je R alkilna grupa ravnog lanca kao C₁₈H₃₇ ili C₈H₁₇. Vrijeme zadržavanja je duže za manje polarne supstance. Vrijeme zadržavanja se povećava dodatkom polarnih rastvarača u mobilnu fazu a smanjuje se dodatkom hidrofobnih rastvarača. RP-HPLC funkcioniše na principu hidrofobnih interakcija, koje su rezultat odbijajućih sila između polarnog rastvarača i relativno nepolarne supstance koja se analizira i nepolarne stacionarne faze.

Na brzinu eluiranja utiče pH, zbog mogućnosti promjene polarnosti supstance. Zbog toga se često u mobilnu fazu dodaju puferi. Kolone za RP-HPLC ne bi trebalo koristiti sa jakim bazama, zbog mogućnosti razgradnje silikatnih čestica.

Komponente uređaja za HPLC

Uređaj za HPLC se sastoji od sljedećih komponenata:

• Rezervoar mobilne faze
• Pumpa
• Injektor
• Kolona
• Detektor

Detektori za HPLC

Detektor ima važnu ulogu da detektuje komponente koje izlaze iz kolone nakon eluiranja. Detektor generiše električni signal koji je proporcionalan intenzitetu neke osobine mobilne faze ili supstance koja se eluira. Tipovi detektora u HPLC-u su:

• UV-VIS detektor
• Fluorescentni detektor
• Elektrohemijski detektor
• Detektor indeksa loma
• Maseni spektrometar (MS)

Također pogledajte

• Hromatografija

Vanjski linkovi

1. Basic Liquid Chromatography, Textbook on HPLC (full) Arhivirano 15. 1. 2008. na Wayback Machine
2. A guide to HPLC
3. LC Equipment