Proteinske metode

(Preusmjereno sa Proteinski metodi)

Proteinski metodi su tehnike koje se koriste za proučavanje protein. Postoje eksperimentalne metode za proučavanje proteina (npr. za detekciju proteina, za izolaciju i pročišćavanje proteina i za karakterizaciju strukture i funkcije proteina, često zahtijevajući da se protein prvo pročisti). Računarske metode obično koriste kompjuterske programe za analizu proteina. Međutim, mnoge eksperimentalne metode (npr. masena spektrometrija) zahtijevaju računsku analizu sirovih podataka.

Genetički metodi

uredi

Eksperimentalna analiza proteina obično zahtijeva ekspresiju i pročišćavanje proteina. Ekspresija se postiže manipulacijom DNK koja kodira protein(e) od interesa. Dakle, analiza proteina obično zahtijeva DNK metode, posebno kloniranje. Neki primjeri genetičkih metoda uključuju konceptualno prevođenje, sajt-usmjerenu mutagenezu, korištenje fuzijskog proteina i podudaranje alela sa stanjima bolesti. Neki proteini nikada nisu direktno sekvencirani, ali prevođenjem kodona iz poznatih sekvenci iRNK u aminokiseline, metodom poznatom kao konceptna translacija. (Pogledajte genetički kod.) Mutageneza usmjerena na mjesto selektivno uvodi mutacije koje mijenjaju strukturu proteina. Funkcija dijelova proteina može se bolje razumjeti proučavanjem promjene fenotipa kao rezultat ove promjene. Fuzijski proteini se prave umetanjem proteinskih oznaka, kao što je His-tag, kako bi se proizveo modificirani protein koji je lakše pratiti. Primjer za to bi bio GFP-Snf2H koji se sastoji od proteina vezanog za zeleni fluorescentni protein kako bi se formirao hibridni protein. Analizom DNK alela mogu se identifikovati kao povezani sa bolesnim stanjima, kao što je u izračunavanje LOD rezultata.

Ekstrakcija proteina iz tkiva

uredi

Ekstrakcija proteina iz tkiva sa čvrstim vanćelijskim matriksom (npr. uzorci biopsije, venskatkiva, hrskavica, koža) se često postiže u laboratorijskim uslovima udarnim prahom u tečnom dušiku. Uzorci se zamrzavaju u tekućem dušiku i potom podvrgavaju udarcima ili mehaničkom mljevenju. Kako voda u uzorcima na ovoj temperaturi postaje vrlo krhka, uzorci se često svode na zbirku finih fragmenata, koji se zatim mogu otopiti za ekstrakciju proteina. U tu svrhu se ponekad koriste uređaji od nehrđajućeg čelika, poznati kao drobilice tkiva. Prednosti ovih uređaja uključuju visok nivo ekstrakcije proteina iz malih, vrijednih uzoraka, nedostaci uključuju nizak nivo unakrsne kontaminacije.

Otkrivanje proteina

uredi

Prilično mala veličina proteinskih makromolekula čini identifikaciju i kvantifikaciju nepoznatih uzoraka proteina posebno teškim. Razvijeno je nekoliko pouzdanih metoda za kvantifikaciju proteina kako bi se proces pojednostavio. Ove metode uključuju Warburg-Christianov metod, Lowryjev test i Bradfordov test (svi se oslanjaju na svojstva apsorpcije makromolekula). Bradfordov metod analize koristi boju da se veže za protein. Najčešće se koristi Coomassie brilliant blue G-250 bojau. Kada nema proteina, boja je crvena, ali kada se veže za protein postaje plava. Kompleks boja-protein maksimalno apsorbuje svetlost na talasnoj dužini 595 nanometara i osetljiv je na uzorke koji sadrže od 1 ug do 60 ug. Za razliku od Lowryjevog i Warburg-Christianog metoda, Bradfordovi testovi se ne oslanjaju na sadržaj triptofana i tirozina u proteinima, što omogućava da metod bude hipotetski precizniji.

Lowryjev test je sličan biuretskim testovima, ali koristi Folinski reagens koji je precizniji za kvantifikaciju. Folin reagens je stabilan samo u kiselim uslovima i metod je podložan iskrivljenim rezultatima u zavisnosti od toga koliko je triptofana i tirozina prisutno u ispitivanom proteinu. Folinski reagens se veže za triptofan i tirozin, što znači da koncentracija dvije aminokiseline utiče na osjetljivost metoda. Metod je osjetljiv u rasponima koncentracija sličnim Bradfordovom metodu, ali zahtijeva neznatnu količinu više proteina.

Warburg-Christianov metod provjerava proteine u njihovim prirodnim rasponima apsorpcije. Većina proteina vrlo dobro apsorbira svjetlost na 280 nanometara, zbog prisustva triptofana i tirozina, ali je osjetljiv na različite količine aminokiselina na koje se oslanja.

Više metoda je navedeno ispod koje se povezuju sa detaljnijim računima za njihove primjene.

Nespecifične metode koje otkrivaju samo ukupne proteine

uredi

Specifični metodi otkrivanja količine jednog proteina

uredi

Proteinske strukture

uredi

Interakcije koje uključuju proteine

uredi

Interakcije protein-protein

uredi

Interakcije protein-DNK

uredi

Interakcije protein-RNK

uredi

Računarski metodi

uredi

Ostali metodi

uredi

Također pogledajte

uredi

Bibliografija

uredi
  • Daniel M. Bollag, Michael D. Rozycki and Stuart J. Edelstein. (1996.) Protein Methods, 2 ed., Wiley Publishers. ISBN 0-471-11837-0.

Reference

uredi