Nokaut-miš

Nokaut miš ili nokautirani miš je genetički modificirani miš (Mus musculus) u kojem istraživači inaktiviraju ili "nokautiraju" postojeći gen, zamjenom ili ometanjem njegove ekspresije vještačkim komadom DNK. Ovakvi miševi su važni modelni organizmi za proučavanje uloge gena koji su bili sekvencirani, ali čije funkcije nisu utvrđene. Izazivajući neaktivnost određenog gena u miša, a poštujući sve razlike od normalnog ponašanja ili fiziologije, istraživači mogu zaključivati o njegovoj vjerovatnoj funkciji.^[1]^[2]^[3]^[4]

Miševi su trenutno vrsta laboratorijskih životinja koje su najuže povezane sa ljudima na koje se lahko može primijeniti nokaut tehnika. Oni se naširoko koriste u nokaut eksperimentima, posebno onim koji istražuju genetičke pitanja koja se odnose na fiziologiju čovjeka. Genski nokaut u smeđeg pacova je mnogo teži i bio je moguć tek od 2003. godine.^[5]^[6]

Prvog poznatog nokaut miša su kreirali Mario R. Capecchi, Martin Evans i Oliver Smithies 1989. i za to dobili Nobelovu nagradu za fiziologiju ili medicinu, 2007. Aspekti tehnologije za stvaranje nokaut miševa, a i sami miševi su bili patentirani u mnogim zemljama, preko privatnih kompanija.

Upotreba

Laboratorijski miš kod kojeg je nokautiran gen za rast dlake (lijevo), upoređen sa normalnim laboratorijskim mišem

Isključivanje aktivnosti gena omogućava dobijanje informacija o tome što taj gen normalno radi. Ljudi imaju mnoge zajedničke gene s miševima. Shodno tome, poštujući karakteristike nokautiranih miševa, daje istraživačima informacije koje se mogu koristiti kako bi se bolje razumjelo kako sličan gen može uzrokovati ili doprinijeti nekoj bolesti kod ljudi.

Primjeri istraživanja u kojima su nokaut miševi bili korisni uključuju proučavanje i modeliranja različitih vrsta raka, gojaznosti, bolesti srca, dijabetes melitus, artritisa , te oblika ponašanja, kao što su zloupotreba supstanci, anksioznost, starenje i Parkinsonova bolest. Nokaut miševi također nude biološke i naučni kontekst u kojem se mogu razvijati i testirati lijekovi i druge terapije.^[3]

Svake godine se u svijetu izvedu milioni eksperimenata sa nokaut miševima.^[7]

Sojevi

Nokaut miš (lijevo) koji je model za gojaznost, upoređen sa normalnim mišem

Postoji nekoliko hiljada različitih sojeva nokautiranih miševa.^[7] Mnogi modeli miševa su imenovani po gen koji je inaktiviran. Naprimjer, p53 nokaut miš je dobio ime po p53 genu koji kodira sintezu proteina koji inače sprečava rast tumora, sprečavanjem podjela ćelija i / ili indukcijom apoptoze. Ljudi rođeni s mutacijom kojea deaktivira p53 gen, pate od Li-Fraumeni sindroma, stanja koje dramatično povećava rizik od razvoja raka kostiju, dojke i raka krvi, u ranoj dobi. Ostali modelni miševi se zove, često sa dozom kreativnosti, prema njihovim fizičkim karakteristikama ili ponašanju.

Postupak

Procedura za pravljenje blastocista mješovitog genotipa

Prikaz postupka za uzgoj i proizvodnju nokaut miševa.
Ćelije koje sadrže blastociste, sa divljim tipom i nokaut ćelijama, ubrizgavaju se u maternicu pomajke.
To stvara potomstvo ili divljeg tipa i obojeni su iste boje kao i blastociste donora (siva) ili himerno (mješovito) i djelomično nokautirano.
Himerni miševi su ukršteni sa normalnim miševima divljeg tipa (sivi).
To stvara potomstvo koje je ili bijelo i heterozigotno za nokautirani gen ili sivo – divlji tip.
Bijeli heterozigotni miševi mogu biti naknadno ukršteni za proizvodnju miševa koji su homozigotni za nokautirao gen.

Postoji nekoliko varijacija postupaka zs proizvodnju nokaut miševa; slijedi tipski primjer.

Gen koji se nokautira je izoliran iz biblioteke gena miša. Zatim se napravi nova sekvenca DNK, koja je vrlo slična originalnom genu i njegovj neposredno susjednoj sekvenci, osim što je dovoljno promijenjen da bi gen bio neupotrebljiv. Obično, nova sekvenca također dobija i marker gen, gen koji normalni miševi nemaju i da se daje otpornost na određeni toksični agens (npr. neomicin) ili proizvodi vidljive promjene (npr. boje ili fluorescenciju). Osim toga, drugi gen, kao što je herpes tk +, također je uključen u ovaj konstrukt, kako bi se postigla potpuna selekcija.^[3]
Embrionske matične ćelije se izoliraju iz mišjih blastocista (vrlo mladog embriona) i uzgajaju in vitro. Naprimjer, uzimaju se matične ćelije bijelog miša.
Nova sekvenca iz koraka 1 uvede se u matične ćelije iz koraka 2 putem elektroporacije. Prirodnim procesom homologne rekombinacije neke od electroporiranih matičnih ćelija će ugraditi nove sekvence sa nokaut genom u svoje hromosome, na mjesto originalnog gena. Šanse za uspješno događanje rekombinacije su relativno niske, tako da većina izmenjenih ćelija ima novu sekvencu u samo jednom od dva relevantna hromosoma – oni su, kaže se heterozigotni. Ćelije koje su pretočene u vektor koji sadrži gen za otpornost na neomicin i herpes TK + gen se uzgajaju u otopini koja sadrži neomicin i Ganciclovir kako bi se odabrale transformacije koje su se desile preko homologne rekombinacije. Bilo koja insercija DNK koja se dogodila slučajni će umrijeti, jer su pozitivne i za otpornost gena na neomicin i herpes tk + gen, čiji je genski proizvod reagira s ganciklovirom proizvodeći smrtonosni otrov. Osim toga, ćelije koje ne integriraju ni bilo koji testirani genetički materijal koji je negativan za oba gena, stoga će umrijeti, zbog posljedica trovanja neomicinom.
Embrionske matične ćelije koje ugrade nokaut gen, izolirane su iz nepromijenjenih ćelija pomoću marker gena prvog koraka, naprimer, nepromijenjene ćelije mogu biti ubijene koristeći toksične agense na koje su izmenjene ćelije otporne.
Nokaut embrionalne matične ćelije iz koraka 4 se ubacuju u blastociste miša. Za ovaj primjer, koristimo blastociste iz sivog miša. Blastociste sada sadrže dvije vrste matičnih ćelija: originalne (iz sivog miša) i nokaut ćelije (bijelog miša). Ove blastociste se potom ugrađuju u materice ženki miševa, gdje se razvijaju. Novorođeni miševi će stoga biti himere: neki dijelove tijela proizilaze iz originalne matičnih ćelija, drugi dijelov iz nokaut matičnih ćelija. Njihovo krzno će pokazati mrlje bijele i sive boje, s bijelim zakrpeama izvedenim iz nokaut matičnih ćelija i sive mrlje iz blastocista primatelja.
Neki od novorođenih himernih miševa će imati gonade izvedeni iz nokaut matičnih ćelija, a time će se proizvoditi jaja ili spermu koja sadrži nokaut gen. Kada se ovi himerni miševi ukrštaju sa drugima divljim vrstama, neki od njihovih potomaka će u svim svojim ćelijama imati jednu kopiju nokaut gena. Ovi miševi će biti potpuno bijeli i nisu himere, međutim, oni su i dalje heterozigoti.
Kada se ovo heterozigotno potomstvo međusobno ukršta, neki od njihovih potomaka će naslijediti nokaut gen od oba roditelja; oni ne nose funkcijsku kopiju originala nepromijenjenog gena (odnosno oni su su homozigoti za taj alel).^[3]

Detaljno objašnjenje o tome kako se stvaraju nokaut (KO) miševi nalazi se na web stranici Nobelova nagrada za fiziologiju ili medicinu 2007. godine.^[8]

Ograničenja

Nacionalne institucije za zdravlje raspravljaju o nekim značajnim ograničenjima ove tehnike.^[9]

Iako tehnologija nokaut miševa predstavlja vrijedan istraživački alat, postoje neka važne ograničenja. Oko 15 % nokaut gena je razvojno smrtonosno, što znači da genetički promijenjen embrion ne može prerasti u odraslog miša. Ovaj problem se često prevaziđe upotrebom uvjetnih mutacija. Nedostatak studija o odraslim miševima i u embrionskom razvoju, često čini težim određivanje funkcije gena u odnosu na ljudsko zdravlje. U nekim slučajevima, gen može poslužiti za različite funkcije kod odraslih i u embrionu u razvoju.

Nokaut gen možda i neće proizvesti vidljive promjene u miša ili čak može proizvesti različite karakteristike od onih kod ljudi u kojima se inaktivira isti gen. Naprimjer, mutacije u p53 genu su povezane s više od polovine pojave ljudskog raka i često dovode do tumora u određenom skupu tkiva. Međutim, kada je p53 gena nokautiran u miševa, životinje razvjaju tumor u nizu različitih tkiva.

Postoji varijabilnost u cijelom postupku ovisno, u velikoj mjeri, o sojevima iz kojih su izvedene matične ćelije. Općenito se koriste ćelije dobijene iz soja 129. Ovaj specifični soj nije pogodan za mnoge eksperimente (npr., u ponašanju), tako da je vrlo uobičajeno povratno ukrštanje potomstva sa drugim sojevima. Neke genomske lokuse, kako je dokazano, vrlo teško je nokautirati. Razlozi mogu biti prisustvo ponavljajućih sekvenci, opsežna DNK metilacija ili heterohromatin. Zbunjujućih prisustvo susjednih 129 gena na nokaut segmentu genetičkog materijala je nazvano "bočno-genski efekt".^[10] Predloženi su metodi i vodiči za ovaj problem.^[11]^[12]

Drugo ograničenje je da konvencijski (bezuvjetni) nokaut miševa razvijaju u nedostatku gena pod istragom. Vremenom, gubitak aktivnosti tokom razvoja može prikriti ulogu gena u stanju odraslih, posebno ako je gen uključen u brojne procese u rasponu razvoja. Zatim se traže uvjetni/ inducibilni pristupi mutacijama da se prvo omogući razvoj i zrelost miša, normalno prije ablacije gena od interesa.

Ostala ozbiljna ograničenja se odnose na nedostatak evolucijske prilagodbe u nokaut modelu koje se mogu javiti kod divljih životinja, nakon što su prirodno mutirale. Naprimjer, eritrocitims specifična koekspresija GLUT1 stomatina predstavlja kompenzacijski mehanizam u sisara koji su u stanju sintetizirati vitamin C.^[13]

Također pogledajte

Reference

^ Kapur Pojskić L. (2014). Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju, 2. izdanje. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo. ISBN 978-9958-9344-8-3.
^ Alberts B.; et al. (2002). Molecular Biology of the Cell, 4th Ed. Garland Science. ISBN 0-8153-4072-9. Eksplicitna upotreba et al. u: |author= (pomoć)
^ ^a ^b ^c ^d Bajrović K, Jevrić-Čaušević A., Hadžiselimović R., Eds. (2005). Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB) Sarajevo. ISBN 9958-9344-1-8.CS1 održavanje: više imena: authors list (link)
^ Hadžiselimović R., Pojskić N. (2005). Uvod u humanu imunogenetiku. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo. ISBN 9958-9344-3-4.
^ Helen R. Pilcher (19. 5. 2003). "It's a knockout". Nature. doi:10.1038/news030512-17. Pristupljeno 3. 4. 2014. journal zahtijeva |journal= (pomoć)
^ [https://web.archive.org/web/20100611201320/http://molpharm.wisc.edu/Faculty/fac_pages/gould/Pub12754522.pdf Arhivirano 11. 6. 2010. na Wayback Machine Y Zan et al., Production of knockout rats using ENU mutagenesis and a yeast-based screening assay, Nat. Biotechnol. (2003) http://molpharm.wisc.edu/Faculty/fac_pages/gould/Pub12754522.pdf Arhivirano 11. 6. 2010. na Wayback Machine |date=20100611201320 }}
^ ^a ^b "Background on Mouse as a Model Organism". genome.gov. 23. 5. 2012. Pristupljeno 3. 4. 2014.
^ "The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2007". Nobelprize.org. 19. 9. 1985. Pristupljeno 3. 4. 2014.
^ "Knockout Mice Fact Sheet". Genome.gov. 11. 7. 2013. Pristupljeno 3. 4. 2014.
^ Gerlai R (maj 1996). "Gene-targeting studies of mammalian behavior: is it the mutation or the background genotype?". Trends in Neurosciences. 19 (5): 177–81. doi:10.1016/S0166-2236(96)20020-7. PMID 8723200. Pristupljeno 7. 3. 2010.
^ Wolfer DP; Wim Crusio; Lipp HP (juli 2002). "Knockout mice: simple solutions to the problems of genetic background and flanking genes". Trends in Neurosciences. 25 (7): 336–40. doi:10.1016/S0166-2236(02)02192-6. PMID 12079755. Pristupljeno 7. 3. 2010. Nepoznati parametar |name-list-format= zanemaren (prijedlog zamjene: |name-list-style=) (pomoć)
^ Crusio WE, Goldowitz D, Holmes A, Wolfer D (februar 2009). "Standards for the publication of mouse mutant studies". Genes, Brain and Behavior. 8 (1): 1–4. doi:10.1111/j.1601-183X.2008.00438.x. PMID 18778401. Pristupljeno 7. 3. 2010.CS1 održavanje: upotreba parametra authors (link)^{[mrtav link]}
^ Montel-Hagen, Amélie; Kinet, Sandrina; Manel, Nicolas; Mongellaz, Cédric; Prohaska, Rainer; Battini, Jean-Luc; Delaunay, Jean; Sitbon, Marc; Taylor, Naomi (21. 3. 2008). "Erythrocyte Glut1 triggers dehydroascorbic acid uptake in mammals unable to synthesize vitamin C". Cell. 132 (6): 1039–1048. doi:10.1016/j.cell.2008.01.042. PMID 18358815.

Vanjski linkovi

Texas A&M Institute for Genomic Medicine (TIGM) – The website for ordering ES cells and mice generated by TIGM
Creating Knockout Mice for Targeting Vector from Knockout Mice Research(KMR) – A website for ordering embryonic stem cells,targeting vectors and transgenic mice generated by KMR.
Studying Gene Function: Creating Knockout Mice – a review from the Science Creative Quarterly
The Knock Out Mouse Project (KOMP) Data Coordination website – The public interface for information on the status of the genes included in the KOMP initiative.
The Knock Out Mouse Project (KOMP) Repository website Arhivirano 9. 10. 2020. na Wayback Machine – The website for ordering ES cells, vectors, and mice generated by the KOMP project
Mouse Genome Informatics (MGI) website – community model organism database for the laboratory mouse
Homologous Recombination Method (and Knockout Mouse)

[Kapur_Pojskić-1] Kapur Pojskić L. (2014). Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju, 2. izdanje. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo. ISBN 978-9958-9344-8-3.

[<"Alberts"-2] Alberts B.; et al. (2002). Molecular Biology of the Cell, 4th Ed. Garland Science. ISBN 0-8153-4072-9. Eksplicitna upotreba et al. u: |author= (pomoć)

[Bajrović-3] Bajrović K, Jevrić-Čaušević A., Hadžiselimović R., Eds. (2005). Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB) Sarajevo. ISBN 9958-9344-1-8.CS1 održavanje: više imena: authors list (link)

[Hadžiselimović-Pojskić-4] Hadžiselimović R., Pojskić N. (2005). Uvod u humanu imunogenetiku. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo. ISBN 9958-9344-3-4.

[5] Helen R. Pilcher (19. 5. 2003). "It's a knockout". Nature. doi:10.1038/news030512-17. Pristupljeno 3. 4. 2014. journal zahtijeva |journal= (pomoć)

[6] [https://web.archive.org/web/20100611201320/http://molpharm.wisc.edu/Faculty/fac_pages/gould/Pub12754522.pdf Arhivirano 11. 6. 2010. na Wayback Machine Y Zan et al., Production of knockout rats using ENU mutagenesis and a yeast-based screening assay, Nat. Biotechnol. (2003) http://molpharm.wisc.edu/Faculty/fac_pages/gould/Pub12754522.pdf Arhivirano 11. 6. 2010. na Wayback Machine |date=20100611201320 }}

[genome.gov-7] "Background on Mouse as a Model Organism". genome.gov. 23. 5. 2012. Pristupljeno 3. 4. 2014.

[8] "The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2007". Nobelprize.org. 19. 9. 1985. Pristupljeno 3. 4. 2014.

[9] "Knockout Mice Fact Sheet". Genome.gov. 11. 7. 2013. Pristupljeno 3. 4. 2014.

[pmid8723200-10] Gerlai R (maj 1996). "Gene-targeting studies of mammalian behavior: is it the mutation or the background genotype?". Trends in Neurosciences. 19 (5): 177–81. doi:10.1016/S0166-2236(96)20020-7. PMID 8723200. Pristupljeno 7. 3. 2010.

[pmid12079755-11] Wolfer DP; Wim Crusio; Lipp HP (juli 2002). "Knockout mice: simple solutions to the problems of genetic background and flanking genes". Trends in Neurosciences. 25 (7): 336–40. doi:10.1016/S0166-2236(02)02192-6. PMID 12079755. Pristupljeno 7. 3. 2010. Nepoznati parametar |name-list-format= zanemaren (prijedlog zamjene: |name-list-style=) (pomoć)

[pmid18778401-12] Crusio WE, Goldowitz D, Holmes A, Wolfer D (februar 2009). "Standards for the publication of mouse mutant studies". Genes, Brain and Behavior. 8 (1): 1–4. doi:10.1111/j.1601-183X.2008.00438.x. PMID 18778401. Pristupljeno 7. 3. 2010.CS1 održavanje: upotreba parametra authors (link)^{[mrtav link]}

[13] Montel-Hagen, Amélie; Kinet, Sandrina; Manel, Nicolas; Mongellaz, Cédric; Prohaska, Rainer; Battini, Jean-Luc; Delaunay, Jean; Sitbon, Marc; Taylor, Naomi (21. 3. 2008). "Erythrocyte Glut1 triggers dehydroascorbic acid uptake in mammals unable to synthesize vitamin C". Cell. 132 (6): 1039–1048. doi:10.1016/j.cell.2008.01.042. PMID 18358815.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]