Genski nokaut
Genski nokaut (KO) je genetička tehnika u kojoj se geni jednog organizma učine neoperativnim ("nokaut" organizam). Ovakve jedinke također su poznate kao nokautirani organizmi ili jednostavno nokauti. Oni se koriste u proučavanju funcije gen koji je sekvenciran, koja je nepoznate ili nepotpuno poznata. Istraživači izvlače zaključke iz razlika između nokaut organizama i normalnih jedinki.[1][2]
Termin se odnosi na proces stvaranja takvog organizma, kao u "nokautiranju" gena. Tehnika je u suštini suprotna od nokautiranja gena. Nokaut dva gena istovremeno u organizmu je poznat kao dvostruki nokaut (DKO). Slično tome, izrazi trostruki nokaut (TKO) i četverokrevetne nokauta (qKo) se koriste za opisivanje tri ili četiri nokautirana gena.
Metod
uredi
Nokaut se postiže kombinacijom tehnika, počevši u epruveti s plazmidima, bakterijskog vještačkog hromosoma ili drugog DNK konstrukta i postupaka u kulturi ćelija. Individualne ćelije se genetički transfektiraju DNK konstruktom. Često je cilj je da se stvori transgenih životinja koja ima izmenjeni gen. Ako je tako, embrionske matične ćelije se genetički transformiraju ubacivanjem gena u ranim fazama embrionskog razvoja. Tako nastaju životinje s genetskičkim promjenama u njihovim geminativnim ćelijama, tako da se često nokautirani gen prenosi u buduće generacije.
Za kreiranje nokaut mahovine, preporučljivi način je transfekcija protoplasta. Tako transformiran protoplast Physcomitrella patens direktno regenerira u plodne biljke mahovine. Osam sedmica nakon transfekcije, biljke mogu biti snimane za detekciju ciljanog gena putem PCR.[3]
Physcomitrella divljeg tipa i transformirane biljke su uzgajane na minimalnim Knopovom mediju, koji omogućava diferencijaciju i razvoj gametofora.
Za svaku biljku, pregled (gornji red: bar skala odgovara 1 mm, donji red: 0,5 mm).
A: Haploidna biljka divljeg tipa potpuno prekriven lisnatim gametoforama i izbliza list divljeg tipa.
B-D: Razni mutanti[4]
Konstrukt je napravljen tako da je genetička rekombinacija bila sa ciljnim genom, čiime se postiže uključivanje sekvence DNK iz samog gena u konstrukt. Rekombinacija se onda javlja u regiji te sekvence unutar gena, što rezultira insercijom strane sekvence u poremećeni gen. Sa prekinutom sekvencom, izmenjeni gen u većini slučajeva će biti preveden u nefunkcionalni protein, ako se uopće i prevede.
Uvjetni genski nokaut omogućava deleciju gena u tkivu ili na vremenski specifičan način. To se radi uvođenjem kratkih sekvenci zvanih loxP mjesta širom gena. Ove sekvence će uvesti u klicine linije putem istih mehanizama kao što je nokaut. Ova klicina linija se zatim može ukrstiti sa drugom klicinom linijom (gem-linijom) koja sadrži Cre-rekombinazu koja je virusni enzim sa sposobnošću prepoznavanja ove sekvence, rekombinuje ih i deletira gen koji je okružen ovim mjestima.
Budući da je željeni tip DNK rekombinacije rijedak događaj u slučaju većine ćelija i većine konstrukata, odabrana strana sekvenca za umetanje obično uključuje reporter gen. To omogućava jednostavan izbor ćelije ili jedinke u kojoj je nokaut bio uspješan. Ponekad DNK izgradi insercije (umetke) u hromosom, bez željene homologne rekombinacije sa ciljanim genom. Da bi se takve ćelije uklonile, DNK konstrukt često sadrži drugu regiju DNK, koja omogućava da se takve ćelije identificiraju i odbace.
Kod diploidnih organizama, koji sadrže dva alela za najveći broj gena, može i da sadrži nekoliko povezanih gena da sarađuju u istoj ulozi, dodatnom krugu transformacije i selekcije koja se obavlja dok svaki ciljani gen ne bude nokautiran. Za proizvodnju homozigotnih nokaut životinja, može biti potrebno selektivno ukrštanje
Upotreba
urediNokauti se prvenstveno koriste da se shvati uloga specifičnog gena ili regije DNK, poređenjem nokaut organizama sa divljim tipom sa sličnom genetičkom pozadinom. Također se koriste kao skrining alati u razvoju lijekova, ciljanjem specifične bioloških procesa ili nedostataka pomoću određenog nokauta, ili da se shvati mehanizam djelovanja lijekova pomoću genskih biblioteka u nokaut urganizmima, u rasponu cijelog genoma, kao u Saccharomyces cerevisiae.[5]
Također pogledajte
urediReference
uredi- ^ Kapur Pojskić L. (2014). Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju, 2. izdanje. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo. ISBN 978-9958-9344-8-3.
- ^ Bajrović K, Jevrić-Čaušević A., Hadžiselimović R., Eds. (2005). Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB) Sarajevo. ISBN 9958-9344-1-8.CS1 održavanje: više imena: authors list (link)
- ^ Ralf Reski (1998): Physcomitrella and Arabidopsis: the David and Goliath of reverse genetics. Trends Plant in Science 3, 209-210
- ^ Egener et al. BMC Plant Biology 2002 2:6 doi:10.1186/1471-2229-2-6
- ^ "Arhivirana kopija". Arhivirano s originala, 29. 9. 2012. Pristupljeno 26. 9. 2016.CS1 održavanje: arhivirana kopija u naslovu (link)
Vanjski linkovi
uredi