Kultura ćelija

Kultiviranje ćelija obuhvata niz metoda i postupaka koji se primjenjuju u uzgoju ćelija i tkiva u kontroliranim uvjetima in vitro.

Epitelne ćelije u kulturi, obojene za keratin (crveno) i DNK (zeleno)

Kultura biljnih ćelija i tkiva

Kultura biljnih ćelija i tkiva omogućava gajenja biljaka i pojedinih biljnih organa u sterilnim uvjetma. Tu mogućnost u in vitro uvjetima prvi je predvidio Haberlandt, 1902. godine. White je 1934. pojasnio hranidbene potrebe biljaka u uvjetitna sterilnog medija. Prvi kompletan hranidbeni medij (koji je sadržavao sve potrebne makroelemente, mikroelemente, šećere, vitamine i biljne hormone) napravili su Murashige i Skoog (1962.). Oni su na spomenutoj podlozi uspjeli dobiti kompletne biljke duhana iz tkiva srčike. Posljednjih 35 godina metod kultura in vitro neprikosnoveno se učvrstio u repertoar bioloških metoda koji, pored fundamentalnog, sve više imaju i aplikativni karakter.^[1]^[2]

Kao što je poznato, sve ćelije biljaka više organizacije nastaju iz zigota (putem mitoznih dioba). Zigot nastaje u spolnom kontaktu dvije haploidne ćelije koje se same po sebi u uvjetitna in vivo ("uživo") ne bi mogle dalje razvijati. Spajanjem spolnih ćelija u zigot nastavlja se kontinuitet i ostali potencijali "pritajene", tj. supresirane (prigušene) specifičnosti sastavnica novonastale unutarćelijske sredine. To daje mogućnosti svakoj ćeliji biljaka da, i nakon diferencijacije, u povoljnim uvjetitna balansa hranljivih materija i hormona, povrati meristemski karakter, te svoje razviće usmjeri u pravcu kompletiranja čitavog novog organizma. Pojava vraćanja ćelije iz diferenciranog stanja na meristetnski nivo (mogucnost ponovnog dijeljenja) naziva se dediferencijacija.

Osobina i potencijali totipotentnosti ("svemogucnosti") posebno se intenzivno primijenjuje u razvoju tehnologije kultura ćelija, tkiva i organa in vitro. Ćelije koje se u cjelini biljnog sistema nalaze pod strogom kontrolom, integralnih funkcija organizma, nakon izdvajanja iz funkcionalne cjeline, do punog izražaja koriste vlastitu totipotentnost.

Metodi in vitro kultura su danas jako razvijeni i usavršeni, do (nekada) neslućenih mogućnosti. Tako u somatskoj embriogenezi iz somatskih (soma = tijelo) ćelija moguce je dobiti embrioide (embrione) koji u kasnijim fazama pogodnim manipuliranjem podloga daju kompletne biljke.

Svaka novonastala diploidna ćelija, nakon mitotske podjele sadrži kompletne (iste) nasljedne informacije - ona je nasljedno totipotentna. U procesu diferencijacije ćelija, raspoložive genetičke mogucnosti se svode samo na određenu funkciju, dok su u uvjetima kultiviranje ćelija prenosi genetička informacija o svim nasljednim obilježjima pripadajuće vrste.

Mogućnosti hibridizacije protoplasta dvije ćelije srodnih vrsta stara je koliko i mogućnost metoda kalemljenja. U početku se smatralo da će doći do fuzije protoplasta kada se kalem postavi i prihvati za podlogu. Međutim, tome se suprotstavlja čvrsticelulozni zid. Otkrićem i izolacijom posebnih enzima (celulaza, hemicelulaza i pektinaza) koji razlažu pojedine strukture ćelijskog zida i opne, prevaziđen je i problem cvrste ćelijske barijere. Goli protoplasti se mogu gajiti na specijalnim podlogama ili spajati, nakon čega ćelijski zid moze biti nadograđen (čak za 24 sata).

U prisustvu odgovarajućih supstanci (natrij-nitrata, polietilen-glikola i dr.) ogoljeli protoplasti se mogu međusobno spojiti. Prva somatska fuzija protoplasta urađena je kod dvije srodne vrste duhana (1972. godine), kojom je dobijen plodni (fertilni) hibrid. Mogućnosti hibridizacije protoplasta rastu sa povećanjem njihove genetičke srodnosti.

Ekspetitnenti se razvijaju i u pravcu dobijanja somatskih hibrida filogenetski udaljenih kategorija. Do krajnjeg cilja ovi eksperitnenti moraju uspješno proći veći broj specijalnih faza - od izolacije protoplasta iz tkiva različitih biljnih vrsta, do indukcije organogeneze fuzioniranih cjelina do razvoja odrasle hibridne biljke. Primjenom odgovarajućih postupaka, dobijeni su (1978.) npr. hibridi iznmeđu krompira i paradajza. Cilj je bio da se dobije biljka koja će istovretneno davati plodove paradajza i gomolje krompira U ekspetimentu je dobijeno 9 biljaka koje su bile sterilne (sterilis = neplodan).

Dosadašnja saznanja i uspješna manipulacija kulturom ćelija i tkiva daje solidnu osnovu za prijenos nekih pozitivnih osobina iz ćelije u ćeliju putem rekombinantne DNK. Putem specijalnih metoda genetičkog inženjerstva, u genetički matetijal (molekule DNK) primatelja moguće je unijeti nasljedne jedinice (gene) stranog porijekla, koji omogućuju da takav organizam stekne sposobnosti koje ranije nije posjedovao (kao ni vrsta kojoj pripada). U prirodnim uvjetitna mogućnost prenošenje svojih gena ima bakterija Agrobacterium, koja kod paradajza izaziva tumor. Dokazano je da je ova baktetija, preko posebnih posrednika (plazmida), sposobna da u jedro ćelija paradajza ugradi gen koji dovodi do promjena gena koji je odgovoran za pojavu tumora. Bakterijski geni u biljnoj ćeliji kontroliraju sintezu nekih posebnih derivata aminokiselina (opina) i izazivaju promnjene u metabolizmu hormona domaćina.

Po ugledu na prethodne pojave, danas se u svijetu intenzivno radi na genetičkoj modiftkaciji privredno značajnih biljaka, koja bi doprinijela njihovom oplemenjivanju. Dosta pažnje privlači ideja da se gen, koji je odgovoran za fiksaciju i redukciju dušika, izolira iz nekog organizma sa takvom sposobnošću ("azotofiksatora") i prenese u ćelije viših biljaka, koje inače nemaju tu sposobnost. Time bi se ostvarile ogrmnne uštede u potrošnji relativno skupih dušičnih đubriva i spriječilo zagađivanje životnog okoliša njihovim vjestačkim preparatima.

Naučnicima je pošlo za rukom da u kulturu tkiva unesu gen svica koji je odgovoran za sintezu enzima luciferaze u biljke duhana. Pojavu svjetlucanja kod svica noću izaziva kontakt bjelancevinaste materije luciferin (koja nastaje u prisustvu enzima luciferaze) i slobodnog kisika. U reakciji se luciferin oksidira, što oslobađa svjetlost. Da bi provjerili učinkovitost ovog postupka, poslije transfera gena za sintezu luciferaze u biljke duhana, naučnici su noću polili biljku vodom koja je sadržavala luciferin, nakon čega se pojavio zućkastozeleni sjaj.

Kultura biljnih ćelija i tkiva u uvjetitna in vitro daje takve mogućnosti koje su se nekada graničile sa naučnom fantastikom. Dovoljno se podsjetiti da je metod kultura in vitro danas vodeći postupak u proizvodnji cvijeća i dobijanju bezvirusnih sorti krompira. Spomenuti metodi su doprinijeli razvoju klonskog šumnarstva, hortikulture, te povećali šansu hibridizacijske selekcije i dobijanja novih klonova, otpotnih na novonastale poremećaje u atmosferi i ostale stresove.

Kultura životinjskih ćelija

Kultivirane HeLa ćelije obojene Hoechstovom bojom: jedra su obojena plavo
(To je bila jedna od prvih linija kultiviranih koje potiču ljudskih od Henriete Lacks, koja je umrla od raka slijepog crijeva.
– naziv linije ćelija potiče od po dva prva slova njenog imena i prezimena)

Kultura animalnih ćelija je tehnika koja se danas široko koristi u raznim granama fundamentalne i primijenjene biologije, od molekularne biologije do biotehnologije. Kultura ćelija se odnosi na kultiviranje disagregiranih ćelija i podrazumijeva njihovo održavanje in vitro, tj. u vještački kontroliranoj sredini koja pogoduje njihovom rastu. Kultiviranje tkiva označava se pojmom kultura tkiva, a tehnika kultiviranja cijelih organa s ciljem praćenja njihove kontinuirane funkcije ili razvoja zove se kultura organa.

Osnivačem kulture ćelija smatra se Ross Harrison, koji je uspio kultivirati neuroblaste embrija žabe 1-4 sedmice u limfnom mediju. Iako je Harrison prvi uspješno kultivirao animalne ćelije 1907. godine, šira primjena ove tehnike u nauci počela je tek kasnih 40-ih i ranih 50-ih godina 20. stoljeća. Prvu kontinuiranu ćelijsku liniju glodara uspostavio je Wilton Earle 1943., a prvu humanu tumorsku ćelijsku liniju (HeLa) uspostavio je Gey 1951. godine.^[3]

Za uspješan rast animalnih ćelijskih kultura in vitro, neophodno je obezbijediti optimalnu sredinu podešavanjem adekvatnih uslova sljedećih faktora:

sadržaj i količina hranljivog medija,
posude za kultivaciju,
temperatura,
koncentracija CO₂,
pH,
sterilnost.

Većina vještačkih medija koji se i danas koriste za kultiviranje ćelija razvijeni su pedesetih godina 20. stoljeća. Jedan od prvih medija za kulturu ćelija je BME medij. Ovaj medij je optimizirao Harry Eagle, a u njegov sastav ulaze samo najesencijalniji sastojci. BME medij je kasnije modificiran povećanjem sadržaja amino kiselina te se tako dobio Eagles minimum essential medium (MEM), dok je Dulbecco povećanjem količine amino kiselina i vitamina za 4 puta razvio Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM). Morgan je sa saradnicima opisao medij (Medium 199), koji sadrži mnogo više komponenti od MEM-a i ima širu primjenu za kultiviranje većeg broja ćelijskih tipova. Moor je sa saradnicima u Roswell Park Memorial Institute, razvio RPMI 1640 medij, koji predstavlja jedan od najuniverzalnijih medija za kultiviranje ćelija.^[4]

Također pogledajte

Reference

^ Međedović S., Maslić E., Hadžiselimović R. (2000): Biologija 2. Svjetlost, Sarajevo, ISBN 9958-10-222-6.
^ Bajrović K, Jevrić-Čaušević A., Hadžiselimović R., Ed. (2005): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 9958-9344-1-8.
^ Ibrulj S., Haverić S., Haverić A. (2008): Citogenetičke metode – Primjena u medicini. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 978-9958-9344-5-2.
^ Haverić S., Čakar J., Haverić A., Parić A. (2014): Kultura ćelija i tkiva. U Pojskić L., editor. Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju, 2. izdanje. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 978-9958-9344-8-3.

Vanjski linkovi

Table of common cell lines from Alberts 4th ed.
Cancer Cells in Culture
Hypertext version of the Cell Line Data Base
Microcarrier Cell Culture Handbook by GE Healthcare Life Sciences Arhivirano 5. 12. 2008. na Wayback Machine
Cell Culture Applications - Resources including application notes and protocols to create an ideal environment for growing cells, right from the start.
Cell Culture Basics - Introduction to cell culture, covering topics such as laboratory set-up, safety and aseptic technique including basic cell culture protocols and video training
Database of Who's Who in Cell Culture and Related Research
Witkowski, Jan A. (2012). "Experimental pathology and the origins of tissue culture: Leo Loeb's contribution". Medical History. 27 (3): 269–88. doi:10.1017/S0025727300042964. PMC 1139336. PMID 6353093.
Coriell Cell Repositories
Strategies for Protein Purification Handbook Arhivirano 5. 12. 2008. na Wayback Machine
An Introduction To Cell Culture. This webinar introduces the history, theory, basic techniques, and potential pit-falls of mammalian cell culture.
The National Centre for Cell Science (NCCS), Pune, India; national repository for cell lines/hybridomas etc.

[1] Međedović S., Maslić E., Hadžiselimović R. (2000): Biologija 2. Svjetlost, Sarajevo, ISBN 9958-10-222-6.

[2] Bajrović K, Jevrić-Čaušević A., Hadžiselimović R., Ed. (2005): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 9958-9344-1-8.

[3] Ibrulj S., Haverić S., Haverić A. (2008): Citogenetičke metode – Primjena u medicini. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 978-9958-9344-5-2.

[4] Haverić S., Čakar J., Haverić A., Parić A. (2014): Kultura ćelija i tkiva. U Pojskić L., editor. Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju, 2. izdanje. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 978-9958-9344-8-3.

[1]

[2]

[3]

[4]