Nasumična amplifikacija polimorfne DNK

Nasumična amplifikacija polimorfne DNK (engleski: Random Amplified Polymorphic DNA – RAPD /čita se "rapid"/) jest vrsta PCR reakcije u kojoj su umnožavajući segmenti DNK slučajni. Za RAPD proceduru stvara se nekoliko proizvoljnih, kratkih prajmera (početnica), sa 8-12 nukleotida, a zatim se nastavlja PCR procesuiranje koristeći veliki predložak genomske DNK, očekujući amplifikaciju fragmenta. Na završetku obrade nastalih uzoraka iz RAPD reakcije, mogu se prikupiti polu-jedinstveni profili.^[1]

RAPD markeri su dekameri (dugi 10 nukleotida) DNK fragmenata iz PCR amplifikacije nasumičnih segmenata genomske DNK sa jednostavnim prajmerima arbitrarnih nukleotidnih sekvenci koje su sposobne diferencirati genetički distinktne jedinke iako ne nužno na ponovljivi način. Koristi se za analizu genetičke raznolikosti individua pomoću nasumičnih prajmera. Zbog problema u eksperimentu obnovljivosti, mnogi znanstveni časopisi više ne prihvataju rezultate eksperimenata samo na osnovu RAPD analize.^[2]

RAPD-u je za umnožavanje potreban samo jedan prajmer.

Za RAPD analizu nije potrebno poznavanje DNK sekvenci ciljanih genoma, jer će se prajmer negdje vezati u njihovom nizu, ali nije pouzdano tačno gdje. To čini ovu metoda popularnom za poređenje DNK onih bioloških sistema koji prethodno nisu bili dovoljno istraženi ili sistema u kojima je relativno malo DNK sekvenci. Nije pogodan za formiranje DNK baze podataka zato što se oslanja na velike , neoštećene početne DNK nizove, pa ima neka ograničenja u korištenju degradiranih DNK uzoraka. Njegova moć detekcije je znatno niža od ciljane, po vrstama specičnih metoda usporedbe DNK, kao što su kratka tandemska ponavljanja. U posljednjih nekoliko godina, RAPD se koristi za karakterizaciju i traganje u filogeniji raznih biljnih i životinjskih vrsta.

Djelovanje

Za razliku od tradicionalnih PCR analiza, RAPD ne zahtijeva nikakva posebna znanja o DNK sekvencama ciljnog organizma: identični 10-merni prajmer će ili neće amplificirati neki segment DNK, ovisno o pozicijama prajmeru komplementarnih sekvenci. Na primjer, nijedan fragment se neće proizvesti ako je prajmer priključenog segmenta suviše daleko ili ako on i 3 'kraj prajmera nisu okrenuti jedan prema drugom. Stoga, ako je došlo do mutacije u DNK predloška na lokaciji koja je prethodno bila komplementarna prajmer, neće biti proizveden PCR proizvod, što rezultira različitim obilježjima umnoženog DNK segmenata na gelu.^[2]

Primjer

RAPD je jeftin, ali moćan metod tipizacije za mnoge vrste bakterija. Slika vidljiva na linku [1] je srebrno-obojen poliakrilamid gel koji pokazuje tri različita RAPD profila generirana prajmerom OPE15 za Haemophilus ducreyi izolate iz Tanzanije, Senegala, Tajlanda, Evrope i Sjeverne Amerike. Izbor prave sekvence za prajmer je veoma važno jer različite sekvence će proizvesti različite ishode i eventualno omogućiti konkretnije prepoznavanje individualnih sojeva pojedina [2]

Prajmer: 5'-A-C-C-G-T-3'
Amplificirana DNK: 5'-A-C-C-G-T-G-G-G-T-C-A-A-C-T-G-G-C-G-C-A-C-C-G-T-A-A-T-T-G-G-C-A-3' 3'-T-G-G-C-A-C-C-C-A-G-T-T-G-A-C-C-G-C-G-T-G-G-C-A-T-T-A-A-C-C-G-T-5'

Prajmerska sekvenca, Komplementarna sekvenca

Ograničenja RAPD analize

Gotovo svi RAPD markeri su dominantni, odnosno nije moguće razlikovati da li je DNK segment je umnožen sa lokusa koji je heterozigot i ima jednu kopiju ili homozigot, sa dvije kopije produktivnog alela). Kodominantni RAPD markeri, posmatrani kao različite veličine DNK segmenata koji su umnoženi iz istog lokusa, otkriveni su samo rijetko.
PCR je enzimska reakcija pa kvalitet i koncentracija kalupa DNK, koncentracije PCR komponenti, u PCR bicikličnim uvjetima može uveliko uticati na ishod. Dakle, RAPD tehnika zavisi notorno od uvjeta laboratorija i potrebe pažljivog razvijanja ponovljivih laboratorijskih protokola.
Promašaji između prajmer i uzoraka mogu dovesti do potpunog odsustvo PCR proizvoda ili samo do smanjene količine proizvoda. Dakle, može se desiti da je rezultate RAPD-a teško interpretirati.

Lokus-specifični, kodominantni RAPD markeri

Polimorfni RAPD marker bend je izolovan iz gela.
To je pojačalo PCR reakciju.
PCR proizvod je kloniran i sekvenciran.
Dizajnirani su novi, duži i specifični prajmer za DNK sekvencu, zvani sekvencirani karakterizirani amplificirani regionlni marker (Sequenced Characterized Amplified Region marker: (SCAR).

Također pogledajte

Reference

^ Williams J.K.G et al. (1990): DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. In: Nucleic Acids Res. Bd. 18, S. 6531-6535. PMID 1979162, PMC 332606 (otvoren puni tekst)
^ ^a ^b Bajrović K, Jevrić-Čaušević A., Hadžiselimović R., Ed. (2005): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 9958-9344-1-8.

[1] Williams J.K.G et al. (1990): DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. In: Nucleic Acids Res. Bd. 18, S. 6531-6535. PMID 1979162, PMC 332606 (otvoren puni tekst)

[Bajrović_K_2005-2] Bajrović K, Jevrić-Čaušević A., Hadžiselimović R., Ed. (2005): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 9958-9344-1-8.

[1]

[2]