Polimorfizam dužine amplificiranih fragmenata
Polimorfizam dužine amplificiranih fragmenata (eng. Amplified Fragment Length Polymorphism: AFLP) јedan је od najznačajnijih i najšire primjenjivanih genetičkih markera u brojnim oblastima bioloških istraživanja. Primjenjuje se naučnim oblastima od molekularne biologije i genetike do mikrobiologije, ekologije i rekonstrukcije evolucijsko-filogenetičkih veza i odnosa. Proučavanje ovog polimorfizma je posebno značajno i u medicini, u procesima genotipizacije.[1]
Analiza uredi
Protokol otkrivanja AFLP polimorfizma uključuje nekoliko glavnih postupaka.
- Dugi lanac DNK makromolekula se najprije siječe pomoću restrikcijskih enzima, koji se inače široko koriste kao rezači (sjekači) molekula DNK na tačno određenim specifičnim mjestima. Svaki pojedinačni prepoznaje ’’svoju’’ sekvencu nukleotida, naprimjer 5'−GТТАТCА−3', pa kada klizi duž lanca, svaki puta prepoznaje taj kod i tu ga siječe. Najčešće su u upotrebi oni restrikcijski enzimi koji prepoznaju i režu sekvence od četiri do šest nukleotida. U ovakvim istraživanjima, obično se koriste po dva specifična enzima, od kojih jedan prepoznaje sekvence od četiri, a drugi od šest nukleotida.
- Zatim sječeni dijelovi DNK na jednom kraju imaju sekvencu koja prepoznaje šestočlani, a na drugom onu koja prepoznaje četveročlani. Spajanje dijelova katalizira enzim ligaza, koja je u funkciji svojevrsnog ljepila za spajanje sekvenci adaptera. Kao adapteri služe poznate oligonukleotidne sekvence. One su tako komponirane da na jednom kraju imaju takav nukleotidni niz koji je komplementaran sekvenci prepoznavanja jednog od korištenih restrikcijskih enzima, a na drugom sekvencu nukleotida koja je komplementarna sekvenci prajmera (početnice) koji će biti upotrebljen u preamplifikaciji. U tom slučaju, adapter ima dvostruku ulogu: njegovim vezanjem za kraj fragmenta nestaje mjesto koje prepoznaju restrikcijski enzimi, uz istovrenmeno uspostavljanje mjesta za koje će se vezati prajmer.
- Sljedeći korak u ovom postupki je preamplifikacija. U reakcijsku smjesu se dodaju prajmeri koji su komplementarni sekvencama adaptera i mjesta prepoznavanja restrikcijskih enzima, uz dodatak jednog nukleotida na 3'kraju. To omogućava da se se umnožavaju samo one sekvence koje na kraju imaju komplement određenog nukleotida, što 16 puta smanjuje broj dijelova za analizu.
- Posljednji postupak u ovom procesu je selektivna amplifikacija. Tada se u reakcijsku smjesu dodaju prethodno određeni prajmeri sa poznatim sekvencama, odnosno sekvencama prajmera koji su korišteni u preamplifikaciji, uz dodatak nekoliko (1-5) nasumičnih nukleotida koji se dodaju na 3'kraju. Odrednicu kojom ovaj postupak selektivne amplifikacije dobija je u tome što je selektivno kontrolisan. Kao završni rezultat, od početnog mnoštva dijelova, аmplificiraju se samo određeni dijelovi, sa obično 50-100 nukleotida.
- Po završetku amplifikacije ostaje rastvor za analizu, koja najprije podrazumijeva elektrogorezu za diferenciranje molekula DNK po veličini, zahvaljujući različitoj pokretljivosti u električnom polju.
Opisana procedura omogućava genetičku identifikaciju i genotipizaciju.
Primjena uredi
Tehnologija AFLP može istovremeno otkrivati različite polimorfizme u različitim regijama genoma. Vrlo je osjetljiva i ponovljiva. Zato se analiza AFLP naširoko koristi za identifikaciju genetičkih varijacija u sojevima ili bliskim vrstama biljaka, gljiva, životinja i bakterija. Tehnologija AFLP se koristi i u kriminološkim laboratorijama, u testiranje roditeljstva, a također i u utvrđivanju malih razlika unutar populacija. U asocijacijskim studijama (povezanosti) mogu generirati mape za lokuse kvantitativnih osobina (‘’QTL’’).
Postoje mnoge prednosti u odnosu na druge tehnologije drugih AFLP markera. Tu su slučajno pojačane polimorfne DNK (RAPD), polimorfizam dužine restrikcijskih fragmenata (RFLP) i mikrosatelita. U odnosu na druge tehnike, AFLP samo nema veću ponovljivost, rezoluciju i osjetljivost na nivou cijelog genoma, ali također ima sposobnost da amplificira između 50 i 100 fragmenata u jednom postupku. Osim toga, nisu potrebne prethodne informacije za amplifikaciju sekvenci. Tehnologija AFLP je zaštićena patentima i patentnim prijavama u Keygene N.V. AFLP je registrovan kao zaštitni znak Keygene N.V.
Reference uredi
- ^ Bajrović K, Jevrić-Čaušević A., Hadžiselimović R., Ed. (2005): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 9958-9344-1-8.
Vanjski linkovi uredi
Softver za analizu AFLP podataka
- BioNumerics One universal platform to manage and analyze all your biological data including AFLP
- KeyGene Quantar Suite Versatile marker scoring software
- SoftGenetics GeneMarker fragment analysis software
Besplatna pomagala za analizu AFLP podataka
- SourceForge Genographer Free software for manual scoring (Java application)
- SourceForge RawGeno Free automated scoring (R CRAN environment, including a user-friendly GUI)
Online programi za simulaciju AFLP-PCR
- ALFIE - BProkaryotes or uploaded sequences
- In silico AFLP-PCR for prokaryotes, some eukaryotes or uploaded sequences
- Enzymes for AFLP New England Biolabs
- AFLP Technology note at KeyGene
- AFLP Applications