Banka gena

Banke gena su svojevrne ostave u kojima se čuva genetički materijal. U užem smislu, predstavljaju kolekciju različitih DNK sekvenci iz nekog organizma kloniranih u vektore s ciljem jednostavne purifikacije, skladištenja i njihove analize.^[1]

U širem smislu, banke gena su i svi drugi oblici skladištenja poželjnog genetičkog materijala. Za biljke, to se postiže odlaganjem u postrojenja ili uskladištenje sjemena (sjemenske banke). Za životinje, uključujući i ljude, zamrzavaju se sperma i jajne ćelije, sve do moguće upotrebe,

Genske banke

Zavisno od porijekla DNK, postoje dva tipa banki gena. Ako se koristi genomska DNK, banka se označava kao genomska, a ako se koristi komplementarna DNK (kopija informacione RNK), onda se označava kao cDNK banka. Prilikom uspostavljanja banke gena treba voditi računa o tome koliko dobro ona predstavlja početni materijal, tj. da mora sadržavati provjereno originalne sekvence. Ako neka sekvenca nije klonirana, banka gena nije reprezentativna. Također, ako banka ne sadrži dovoljan broj klonova postoji vjerovatnoća da će neki geni nedostajati.

Moguće je izračunati broj rekombinanti koje se moraju nalaziti u banci gena da bi osigurali vjerovatnoću da banka sadrži određenu sekvencu po formuli:
N = ln(1-P)/ln(1-a/b);
gdje je:
N − broj rekombinanti,
P − željena vjerovatnoća prisustva određene sekvence (obično je podešena na 0.95 ili 0.99),
a – prosječna veličina inserta i
b − veličina genoma.
Za ispravnost proračuna vrijednosti a i b moraju biti izražene u istim jedinicama.

Kada se radi o organizmima sa malim genomom, kao što je Escherichia coli, genomska banka može biti konstruisana u plazmidnom vektoru. U ovom slučaju samo 5000 klonova, sa prosječnom dužinom inserta od 5 kb, daje 99% mogućnost da je cijeli genom E. coli od 4.6 x 106 bp kloniran. Za organizme sa većim genomom, genomske banke se najčešće konstruišu korištenjem λ faga, kozmida ili vještačkog kvaščevog hromosoma. Ovi vektori mogu prihvatiti insert od 23 do 1000 kb, tako da je potrebno manje rekombinanti za kompletiranje čitavog genoma nego što bi to bilo u slučaju korištenja vektora sa manjim kapacitetom - plazmida. Kada se inserti ligiraju sa vektorskim molekulama, takve rekombinante su spremne za pakovanje i propagaciju i obezbjeđuju dugoročnu stabilnost arhiviranog inserta.^[1]^[2]^[3]

Genomske banke

Za pravljenje genomske banke, genomska DNK mora biti purificirana, a zatim isječena u fragmente koji veličinom odgovaraju kapacitetu izabranog vektora. Purifikacija genomske DNK eukariota odvija se u nekoliko faza koje obuhvataju preparaciju nukleusa, digestiju i ekstrakciju DNK. Ekstrakcija DNK prokariota vrši se direktno, a faze preparacije nukleusa i digestije nisu potrebne zbog karakteristične građe prokariotske ćelije. Dva su osnovna načina fragmentacije DNK: fizičko fragmentiranje i digestija restrikcijskim enzimima. Zajednička osobina oba načina fragmentacije DNK je dobijanje fragmenata slučajne veličine i rasporeda na DNK molekuli.

Slučajno prekidanje mehaničkim miješanjem je veoma prikladno, ali se za dobijanje slučajnih fragmenata znatno češće koristi enzimska restrikcija. U metodi koju su razvili Maniatis i saradnici (1978.), ciljana DNK se digestira smjesom od dvije endonukleaze. Ovi enzimi imaju tetranukleotidna mjesta prepoznavanja koja se pojavljuju veoma često i produkuju fragmente manje od 1 kb. Međutim, digestija se ne provodi do kraja, usljed čega se dobije set relativno velikih prepoklapajućih fragmenata. Većina ovako produciranih fragmenata duga je oko 20 kb, što je pogodno za inserciju u λ fage. U ovoj proceduri koriste se HaeIII i AluI, enzimi koji produciraju tupe krajeve, tako da je za njihovo kloniranje neophodna upotreba linkera. Ova metoda se može pojednostaviti upotrebom samo jednog restrikcijskog enzima kao što je Sau3A. Na ovaj način dobije se set fragmenata koji su manje slučajni nego u tretmanu sa dva enzima. Upotreba Sau3A ima i neke druge prednosti. Na primjer, fragmenti dobijeni upotrebom Sau3A mogu lako klonirati u vektore velikog kapaciteta kao što je λEMBL3. Ovakav vektor može biti pripremljen sa Sau3A ili BamHI, jer ova dva enzima prave iste kohezivne krajeve. Ako se za digestiju DNK koriste restrikcijski enzimi, dužina fragmenata zavisi od tačne lokacije prepoznavajućih sekvenci datog enzima. Npr., EcoRI ima mjesta prepoznavanja u prosjeku na svakih 4096 bp, te proizvodi fragmente koji su suviše kratki za λ vektore.

Umjesto λ faga za konstrukciju genomske banke mogu se koristiti i kozmidni vektori. Kozmidi imaju veći kapacitet od λ faga i visoku efikasnost dobijenu in vitro pakovanjem. Međutim, skrining banaka rekombinantnih λ faga (hibridizacija plakova) daje jasnije rezultate od skrininga banaka bakterija koje sadrže kozmidne rekombinante (hibridizacija kolonija). Amplificirana banka faga može biti pohranjena skoro neograničeno, jer fag ima dug vremenski period tokom kojeg zadržava vijabilnost. U bakterijskim kolonijama koje sadrže kozmide također je moguće pohraniti amplificiranu banku, ali bakterijske populacije se ne mogu pohraniti tako lako kao populacije faga. Također, bakterije vremenom gube vijabilnost.

Također pogledajte

Reference

^ ^a ^b Kapur Pojskić L., Ed. (2014): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju, 2. izdanje. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 978-9958-9344-8-3.
^ Bajrović K, Jevrić-Čaušević A., Hadžiselimović R., Ed. (2005): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 9958-9344-1-8.
^ Hadžiselimović R., Pojskić N. (2005): Uvod u humanu imunogenetiku. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 9958-9344-3-4.

Vanjski linkovi

[Kapur_Pojskić_L._2014-1] Kapur Pojskić L., Ed. (2014): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju, 2. izdanje. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 978-9958-9344-8-3.

[2] Bajrović K, Jevrić-Čaušević A., Hadžiselimović R., Ed. (2005): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 9958-9344-1-8.

[3] Hadžiselimović R., Pojskić N. (2005): Uvod u humanu imunogenetiku. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 9958-9344-3-4.

[1]

[2]

[3]