Usmjerena evolucija

Usmjerena evolucija ili dirigirana evolucija je metod koja se koristi za proizvodnju enzima u industrijske ili medicinske svrhe.

Metod je oblik proteinkog inženjeratva koji oponaš prirodno odabiranje.^[1]

Osnovna ideja je sastaviti gen putem ponovljenih rundi mutacija, kako bi se napravila biblioteka varijanti. Selekcijom se izoliraju geni sa željenom funkcijom. Oni su predložak za sljedeću rundu.^[2]

To se može učiniti in vivo (u živim ćelijama bakterija ili kvasaca) ili in vitro (bez rastvora ili mikro-kapljica).

Testiranje više mutanata povećava šanse da se pronađe onaj sa željenim svojstvima.^[3]

Tokom evolucije in vivo, svaka ćelija (obično bakterijska ili kvaščeva) se transformira putem plazmida, koji sadrži drugog člana bibliotečke varijante. Samo se gen od interesa razlikuje između ćelija, a svi ostali geni ostaju isti.

Ćelije eksprimiraju protein u citoplazmi ili površini plazmamembrana, gdje se može testirati njegova funkcija. Prednost ovog formata je selekcija svojstava u ćelijskom okruženju, što je korisno kada se evoluirani protein ili RNK trebaju koristiti u živim organizmima.^[4]

Kada se radi bez ćelija, metod koristi transkripciju i translaciju in vitro za proizvodnju proteina ili RNK slobodnih u rastvoru ili unutar vještačnih mikrokapi. To ima prednost što omogućava varijaciju više uvjeta (npr. temperatura, rastvarači). Može eksprimirati proteine koji bi bili toksični za ćelije. Dalje, eksperimenti evolucije in vitro mogu stvoriti daleko veće biblioteke (do 10¹⁵) jer biblioteke DNK ne moraju biti ubačeni u ćelije. To često ograničava ono što se može učiniti.

Osiguravanje nasljednosti

Eksprimirani protein može biti kovalentno povezan sa svojim genom (kao u iRNK), lijevo ili staviti u isti boks s njim, desno.
Bilo kako bilo, izoliran je gen koji kodira protein

Kada su izolirani funkcionalni proteini, neophodno je da su i njihovi geni, stoga je potrebna odgovarajuća veza genotip-fenotip.^[5]

Ovo može biti kovalentno, gdje je iRNK gena povezana s proteinom na kraju translacije pomoću puromicina.^[6]

Alternativno, protein i njegov gen mogu se držati zajedno,^[7] ili u emulzijskim kapljicama.^[8] Izolovane sekvence gena se zatim umnožavaju pomoću PCR-a ili u transformiranom bakterijskom domaćinu. Ili se pojedinačna najbolja sekvenca ili skup sekvenci mogu koristiti kao predložak za sljedeći krug mutageneze. Ponovljeni ciklusi diverzifikacije-selekcije-amplifikacije čine enzimske varijacije prilagođene procesu selekcije.

Nagrada

Američk inženjer Frances Arnold osvojio je Millennium Technology Prize za pionirsku režiranu evoluciju.^[9]

Reference

^ Stephen Lutz 2010. Beyond directed evolution - semi-rational protein engineering and design. Curr Opin Biotechnol. 21(6): 734–743.
^ Voigt C.A; Kauffman S. & Wang Z.G. 2000. "Rational evolutionary design: the theory of in vitro protein evolution". Advances in protein chemistry. 55: 79–160. doi:10.1016/s0065-3233(01)55003-2. PMID 11050933.CS1 održavanje: više imena: authors list (link)
^ Dalby P.A. 2011. "Strategy and success for the directed evolution of enzymes". Current Opinion in Structural Biology. 21 (4): 473–80. doi:10.1016/j.sbi.2011.05.003. PMID 21684150.
^ Badran A.H. & Liu D.R. 2014. "In vivo continuous directed evolution". Current Opinion in Chemical Biology. 24C: 1–10. doi:10.1016/j.cbpa.2014.09.040. PMID 25461718.
^ Leemhuis H. et al 2005. "New genotype-phenotype linkages for directed evolution of functional proteins". Current Opinion in Structural Biology. 15 (4): 472–8. doi:10.1016/j.sbi.2005.07.006. PMID 16043338.
^ Lipovsek D. & Plückthun A. 2004. "In-vitro protein evolution by ribosome display and mRNA display". Journal of immunological methods. 290 (1–2): 51–67. doi:10.1016/j.jim.2004.04.008. PMID 15261571.
^ Nguyen A.W. & Daugherty P.S. 2005. "Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET". Nature Biotechnology. 23 (3): 355–60. doi:10.1038/nbt1066. PMID 15696158.
^ Schaerli Y. & Hollfelder F. 2009. "The potential of microfluidic water-in-oil droplets in experimental biology". Molecular bioSystems. 5 (12): 1392–404. doi:10.1039/b907578j. PMID 20023716.
^ Webb, Jonathan 2016. Evolutionary engineer Frances Arnold wins €1m tech prize. BBC News Science & Environment. [1]

[1] Stephen Lutz 2010. Beyond directed evolution - semi-rational protein engineering and design. Curr Opin Biotechnol. 21(6): 734–743.

[2] Voigt C.A; Kauffman S. & Wang Z.G. 2000. "Rational evolutionary design: the theory of in vitro protein evolution". Advances in protein chemistry. 55: 79–160. doi:10.1016/s0065-3233(01)55003-2. PMID 11050933.CS1 održavanje: više imena: authors list (link)

[3] Dalby P.A. 2011. "Strategy and success for the directed evolution of enzymes". Current Opinion in Structural Biology. 21 (4): 473–80. doi:10.1016/j.sbi.2011.05.003. PMID 21684150.

[4] Badran A.H. & Liu D.R. 2014. "In vivo continuous directed evolution". Current Opinion in Chemical Biology. 24C: 1–10. doi:10.1016/j.cbpa.2014.09.040. PMID 25461718.

[5] Leemhuis H. et al 2005. "New genotype-phenotype linkages for directed evolution of functional proteins". Current Opinion in Structural Biology. 15 (4): 472–8. doi:10.1016/j.sbi.2005.07.006. PMID 16043338.

[6] Lipovsek D. & Plückthun A. 2004. "In-vitro protein evolution by ribosome display and mRNA display". Journal of immunological methods. 290 (1–2): 51–67. doi:10.1016/j.jim.2004.04.008. PMID 15261571.

[7] Nguyen A.W. & Daugherty P.S. 2005. "Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET". Nature Biotechnology. 23 (3): 355–60. doi:10.1038/nbt1066. PMID 15696158.

[8] Schaerli Y. & Hollfelder F. 2009. "The potential of microfluidic water-in-oil droplets in experimental biology". Molecular bioSystems. 5 (12): 1392–404. doi:10.1039/b907578j. PMID 20023716.

[9] Webb, Jonathan 2016. Evolutionary engineer Frances Arnold wins €1m tech prize. BBC News Science & Environment. [1]

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]