Lokusno usmjerena mutageneza

Lokusno usmjerena mutageneza je molekulskobiološki metod koji se koristi za izazivanje specifičnih i namjernih promjena u sekvenci DNK u genu i bilo kojem genskom proizvodu. Označava se i kao mutageneza specifična za sajt ili olgonukleotidno usmjerena mutageneza. Primjenjuje se za istraživanje strukture i biološke aktivnosti molekula DNK, RNK i proteina i za proteinsko inženjerstvo.

Mutageneza usmerena na lokaciju jedna je od najvažnijih laboratorijskih tehnika za stvaranje biblioteke DNK, uvođenjem mutacija u sekvence DNK. Postoje brojne metode za postizanje mutageneze usmerene na lokaciju, ali sa sve manjim troškovima sinteze oligonukleotida, a vještačka sinteza gena sada se povremeno koristi kao alternativa lokusno usmerenoj mutagenezi. Od 2013., razvoj CRISPR/Cas9 tehnologije, zasnovan na prokariotskom virusnom odbrambenom sistemu, također omogućava uređivanje genoma, a mutageneza može se izvoditi in vivo s relativnom lahkoćom.^[1]

Historija

Rani pokušaji izazivanja mutageneze pomoću zračenja ili hemijskih mutagena nisu bili specifični za lokaciju, što je stvorilo slučajne mutacije.^[2] Kasnije su korišteni analozi nukleotida i drugih hemikalija za stvaranje lokaliziranih tačkastih mutacija,^[3] a primjeri takvih su aminopurin,^[4] nitrozogvanidin,^[5] i bisulfit.^[6] Mutageneza usmjerena na lokaciju postignuta je 1974., u laboratoriji Charlesa Weissmanna, upotrebom nukleotidnog analoga N⁴-hidroksicitidina, koji inducira tranziciju G-C u A-T.^[7]^[8] Međutim, ovi metodi izazivanja mutageneze ograničene su tipom mutacije, koju mogu postići i nisu tako specifične kao kasnije metode mutageneze usmjerene na mjesto.

U 1971. godini, Clyde Hutchison i Marshall Edgell pokazali su da je moguće proizvesti mutante s malim fragmentima faga ϕX174 i restrikcijske nukleaze.^[9]^[10] Hutchison je kasnije sa svojim suradnikom Michaelom Smithom proizveo fleksibilniji pristup lokusno usmjerenoj mutagenezi, korištenjem oligonukleotida, metodom produženja prajmera s DNK polimerazom.^[11] Kao svoj dio u razvoju ovog procesa, Michael Smith je kasnije podijelio Nobelovu nagradu za hemiju sa Karyjem B. Mullisom, u oktobru 1993., koji je izumio lančanu polimeraznu reakciju.

Osnovni mehanizam

Osnovni postupak zahtijeva sinteza kratkog DNA prajmera. Ovaj sintetski prajmer sadrži željenu mutaciju i komplementaran je s uzorkom DNK oko mjesta mutacije, tako da može hibridizirati sa DNK u genu od interesa. Mutacija može biti promjena jedne baze (tačkasta mutacija), promjena više baza, delecija ili insercija. Jednolančana začetnica (prajmer) se zatim produžava pomoću DNK-polimeraze, koja kopira ostatak gena. Tako kopirani gen sadrži mutirano mjesto, a zatim se uvodi u ćeliju domaćina u vektoru i klonira. Konačno, mutanti se biraju pomoću sekvenciranja DNK, kako bi se provjerilo sadrže li željenu mutaciju.

Pristupi

Prvobitni metod koji je koristio jednosmjerno produženje bio je neučinkovit zbog malog prinosa mutanata. Ova rezultirajuća smjesa sadrži i izvorni nemutirani uzorak, kao i mutirani lanac, stvarajući mješovitu skupinu mutiranih i nemutiranih potomaka. Nadalje, predložak koji se koristi je metiliran, dok je mutantni lanac nemetiliran, a mutanti se mogu odabrati suprotno zbog prisustva sistema reparacije neusklađenosti, koji favorizira metiliranu matricu DNK, što rezultira manjim brojem mutanata. Od tada su razvijeni mnogi pristupi za poboljšanje efikasnosti mutageneze.

Dostupan je veliki broj metoda za vršenje lokusno usmjerene mutageneze,^[12] iako se većina njih rijetko koristi u laboratorijama od ranih 2000-ih, jer novije tehnike omogućavaju jednostavnije i lakše načine uvođenja mutacija specifičnih za mjesto u genima.

Također pogledajte

Reference

^ Hsu PD, Lander ES, Zhang F (juni 2014). "Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering". Cell. 157 (6): 1262–78. doi:10.1016/j.cell.2014.05.010. PMC 4343198. PMID 24906146.
^ Kilbey, B. J. (1995). "Charlotte Auerbach (1899-1994)". Genetics. 141 (1): 1–5. PMC 1206709. PMID 8536959.
^ Shortle, D.; Dimaio, D.; Nathans, D. (1981). "Directed Mutagenesis". Annual Review of Genetics. 15: 265–294. doi:10.1146/annurev.ge.15.120181.001405. PMID 6279018.
^ Caras, I. W.; MacInnes, M. A.; Persing, D. H.; Coffino, P.; Martin Jr, D. W. (1982). "Mechanism of 2-aminopurine mutagenesis in mouse T-lymphosarcoma cells". Molecular and Cellular Biology. 2 (9): 1096–1103. doi:10.1128/MCB.2.9.1096. PMC 369902. PMID 6983647.
^ McHugh, G. L.; Miller, C. G. (1974). "Isolation and Characterization of Proline Peptidase Mutants of Salmonella typhimurium". Journal of Bacteriology. 120 (1): 364–371. doi:10.1128/JB.120.1.364-371.1974. PMC 245771. PMID 4607625.
^ D Shortle; D Nathans (1978). "Local mutagenesis: a method for generating viral mutants with base substitutions in preselected regions of the viral genome". Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (5): 2170–2174. doi:10.1073/pnas.75.5.2170. PMC 392513. PMID 209457.
^ R A Flavell; D L Sabo; E F Bandle; C Weissmann (1975). "Site-directed mutagenesis: effect of an extracistronic mutation on the in vitro propagation of bacteriophage Qbeta RNA". Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (1): 367–371. doi:10.1073/pnas.72.1.367. PMC 432306. PMID 47176.
^ Willi Müller; Hans Weber; François Meyer; Charles Weissmann (1978). "Site-directed mutagenesis in DNA: Generation of point mutations in cloned β globin complementary DNA at the positions corresponding to amino acids 121 to 123". Journal of Molecular Biology. 124 (2): 343–358. doi:10.1016/0022-2836(78)90303-0. PMID 712841.
^ Hutchison Ca, 3.; Edgell, M. H. (1971). "Genetic Assay for Small Fragments of Bacteriophage φX174 Deoxyribonucleic Acid". Journal of Virology. 8 (2): 181–189. doi:10.1128/JVI.8.2.181-189.1971. PMC 356229. PMID 4940243.CS1 održavanje: numerička imena: authors list (link)
^ Marshall H. Edgell, Clyde A. Hutchison, III, and Morton Sclair (1972). "Specific Endonuclease R Fragments of Bacteriophage X174 Deoxyribonucleic Acid". Journal of Virology. 9 (4): 574–582. doi:10.1128/JVI.9.4.574-582.1972. PMC 356341. PMID 4553678.CS1 održavanje: više imena: authors list (link)
^ Hutchison CA, Phillips S, Edgell MH, Gillam S, Jahnke P, Smith M (septembar 1978). "Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence" (PDF). J. Biol. Chem. 253 (18): 6551–60. PMID 681366.
^ Braman, Jeff, ured. (2002). In Vitro Mutagenesis Protocols. Methods in Molecular Biology. 182 (2nd izd.). Humana Press. ISBN 978-0896039100.

Vanjski linkovi

[1] Hsu PD, Lander ES, Zhang F (juni 2014). "Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering". Cell. 157 (6): 1262–78. doi:10.1016/j.cell.2014.05.010. PMC 4343198. PMID 24906146.

[2] Kilbey, B. J. (1995). "Charlotte Auerbach (1899-1994)". Genetics. 141 (1): 1–5. PMC 1206709. PMID 8536959.

[3] Shortle, D.; Dimaio, D.; Nathans, D. (1981). "Directed Mutagenesis". Annual Review of Genetics. 15: 265–294. doi:10.1146/annurev.ge.15.120181.001405. PMID 6279018.

[4] Caras, I. W.; MacInnes, M. A.; Persing, D. H.; Coffino, P.; Martin Jr, D. W. (1982). "Mechanism of 2-aminopurine mutagenesis in mouse T-lymphosarcoma cells". Molecular and Cellular Biology. 2 (9): 1096–1103. doi:10.1128/MCB.2.9.1096. PMC 369902. PMID 6983647.

[5] McHugh, G. L.; Miller, C. G. (1974). "Isolation and Characterization of Proline Peptidase Mutants of Salmonella typhimurium". Journal of Bacteriology. 120 (1): 364–371. doi:10.1128/JB.120.1.364-371.1974. PMC 245771. PMID 4607625.

[6] D Shortle; D Nathans (1978). "Local mutagenesis: a method for generating viral mutants with base substitutions in preselected regions of the viral genome". Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (5): 2170–2174. doi:10.1073/pnas.75.5.2170. PMC 392513. PMID 209457.

[7] R A Flavell; D L Sabo; E F Bandle; C Weissmann (1975). "Site-directed mutagenesis: effect of an extracistronic mutation on the in vitro propagation of bacteriophage Qbeta RNA". Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (1): 367–371. doi:10.1073/pnas.72.1.367. PMC 432306. PMID 47176.

[8] Willi Müller; Hans Weber; François Meyer; Charles Weissmann (1978). "Site-directed mutagenesis in DNA: Generation of point mutations in cloned β globin complementary DNA at the positions corresponding to amino acids 121 to 123". Journal of Molecular Biology. 124 (2): 343–358. doi:10.1016/0022-2836(78)90303-0. PMID 712841.

[9] Hutchison Ca, 3.; Edgell, M. H. (1971). "Genetic Assay for Small Fragments of Bacteriophage φX174 Deoxyribonucleic Acid". Journal of Virology. 8 (2): 181–189. doi:10.1128/JVI.8.2.181-189.1971. PMC 356229. PMID 4940243.CS1 održavanje: numerička imena: authors list (link)

[10] Marshall H. Edgell, Clyde A. Hutchison, III, and Morton Sclair (1972). "Specific Endonuclease R Fragments of Bacteriophage X174 Deoxyribonucleic Acid". Journal of Virology. 9 (4): 574–582. doi:10.1128/JVI.9.4.574-582.1972. PMC 356341. PMID 4553678.CS1 održavanje: više imena: authors list (link)

[Hutchison_et_al.-11] Hutchison CA, Phillips S, Edgell MH, Gillam S, Jahnke P, Smith M (septembar 1978). "Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence" (PDF). J. Biol. Chem. 253 (18): 6551–60. PMID 681366.

[12] Braman, Jeff, ured. (2002). In Vitro Mutagenesis Protocols. Methods in Molecular Biology. 182 (2nd izd.). Humana Press. ISBN 978-0896039100.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]