Proteinska elektroforeza

Proteinska elektroforeza je metod za analizu proteina u tekućini ili ekstraktu. Elektroforeza se može izvesti s malom količinom uzorka na više alternativnih načina sa ili bez potpornog medija: SDS poliakrilamidna gel elektroforeza (ukratko: gel elektroforeza, PAGE ili SDS-elektroforeza), elektroforeza slobodnog protoka, elektrofokusiranje, izotahoforeza, afinitetna elektroforeza, imunoelektroforeza, kontraelektroforeza i kapilarna elektroforeza. Svaki metoda ima mnogo varijacija sa pojedinačnim prednostima i ograničenjima. Gel elektroforeza se često izvodi u kombinaciji sa elektrobloting imunoblotiranjem, kako bi se dale dodatne informacije o specifičnom proteinu. Zbog praktičnih ograničenja, elektroforeza proteina općenito nije prikladna kao preparativni metod.

Metodi denaturirajućeg gela

SDS-PAGE

SDS-PAGE, natrij dodecil-sulfatna elektroforeza na poliakrilamidnom gelu, opisuje kolekciju srodnih tehnika za razdvajanje proteina prema njihovoj elektroforetskoj pokretljivosti (funkcija molekulske težine polipeptidnog lanca) dok je u denaturisanom (nesavijenom) stanju. Kod većine proteina, vezivanje SDS-a na polipeptidni lanac daje ravnomjernu distribuciju naboja po jedinici mase, što rezultira frakcioniranjem po približnoj veličini tokom elektroforeze,

SDS je jak deterdžent koji se koristi za denaturaciju prirodnih proteina u nesavijene pojedinačne polipeptide. Kada se mješavina proteina zagrije na 100 °C u prisustvu SDS-a, deterdžent se obavija oko polipeptidne okosnice. U ovom procesu, unutrašnji naboji polipeptida postaju zanemarljivi u poređenju sa negativnim nabojima koje doprinosi SDS. Tako polipeptidi nakon tretmana postaju štapićaste strukture koje posjeduju ujednačenu gustoću naboja, odnosno isti neto negativni naboj po jedinici dužine. Elektroforetska pokretljivost ovih proteina će biti linearna funkcija logaritma njihovih molekulskih težina.

Nativni gel metodi

Prirodni gelovi, poznati i kao nedenaturirajući gelovi, analiziraju proteine koji su još u savijenom stanju. Dakle, elektroforetska mobilnost zavisi ne samo od omjera naboja i mase, već i od fizičkog oblika i veličine proteina.

Plavi nativni PAGE

BN-PAGE je prirodna PAGE tehnika, gdje Coomassie brilliant blue boja osigurava potreban naboj proteinskim kompleksima za elektroforetsko odvajanje.^[1]^[2] Nedostatak Coomassie-a je taj što u vezivanju za proteine može djelovati kao deterdžent, uzrokujući disocijaciju kompleksa. Još jedan nedostatak je potencijal gašenje hemoluminiscencije (npr. u kasnijim western blot testovima detekcije ili aktivnosti) ili fluorescencija proteina sa prostetskim grupqma (npr. hem ili hlorofil) ili označene fluorescentnim bojama.{

Jsni nativni PAGE

CN-PAGE (uobičajeno poznat kao Native PAGE) odvaja kiseli vodotopivi i membranski protein u poliakrilamidnom gradijentnom gelu. Ne koristi nabijenu boju tako da je elektroforetska pokretljivost proteina u CN-PAGE (za razliku od tehnike promjene naboja BN-PAGE) povezana s unutrašnjim nabojem proteina.^[3] Udaljenost migracije ovisi o naboju proteina, njegovoj veličini i veličini pora gela. U mnogim slučajevima ovaj metod ima nižu rezoluciju od BN-PAGE, ali CN-PAGE nudi prednosti kad god bi Coomassie boja ometala daljnje analitičke tehnike, naprimjer, opisana je kao vrlo efikasna tehnika odvajanja mikroskala za FRET analize.^[4] Također CN-PAGE je blaži od BN-PAGE-u tako da može zadržati labilne supramolekulske sklopove kompleksa membranskih proteina koji su disocirani pod uslovima BN-PAGE.

Kvantitativni nativni PAGE

Savijeni proteinski kompleks od interesa se razdvajaju čisto i predvidljivo zbog specifičnih svojstava poliakrilamidnog gela. Odvojeni proteini se kontinuirano eluiraju u fiziološki eluent i transportuju do kolektora frakcija. U četiri do pet frakcija PAGE, svaki metalni kofaktori se mogu identifikovati i apsolutno kvantificirati pomoću visoke rezolucije ICP-MS. Odgovarajuće strukture izolovanih metaloproteina u ovim frakcijama mogu se odrediti pomoću NMR-spektroskopije.^[5]

Vizualizacija

Najpopularnija proteinska boja je Coomassie brilliant blue. To je anionska boja, koja se nespecifično vezuje za proteine. Proteini u gelu se fiksiraju acetatnom kiselinom i istovremeno boje. Višak boje ugrađen u gel može se ukloniti odbojavanjem istim rastvorom bez boje. Proteini se detektuju kao plave trake na čistoj pozadini (vidi naslovnu sliku).

Kada je potreban osjetljiviji metod od bojenja Coomassieom, obično se koristi srebrno bojenje. Bojenje srebrom je osjetljiva procedura za otkrivanje tragova proteina u gelovima, ali također može vizualizirati nukleinskw kiseline ili polisaharide.

Na tržištu dostupni su metodi vizualizacije bez upotrebe boja kao što su Coomassie i srebro. Naprimjer, Bio-Rad Laboratories prodaje gelove "bez boja" za SDS-PAGE gel elektroforezu. Alternativno, mogu se koristiti reverzibilne fluorescentne boje iz Azure Biosystems kao što su AzureRed ili Azure TotalStain Q.

Slično kao u gel elektroforezama nukleinske kiseline, često se koristi tracking dye. Anionske boje poznate elektroforetske pokretljivosti obično su uključene u pufer za uzorke. Vrlo uobičajena boja za praćenje je Bromfenol blue. Ova boja je vidljiva pri alkalnom i neutralnom pH i predstavlja malu negativno nabijenu molekulu koja se kreće prema anodi. Budući da je veoma mobilna molekula, kreće ispred većine proteina.

Također pogledajte

Reference

^ Schägger, H.; Jagow, G. (1991). "Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form". Anal. Biochem. 199 (2): 223–231. doi:10.1016/0003-2697(91)90094-A. PMID 1812789.
^ Wittig, I.; Braun, H.P.; Schägger, H. (2006). "Blue native PAGE". Nat. Protoc. 1 (1): 418–428. doi:10.1038/nprot.2006.62. PMID 17406264. S2CID 19715017.
^ Wittig, I.; Schägger, H. (Nov 2005). "Advantages and limitations of clear-native PAGE". Proteomics. 5 (17): 4338–46. doi:10.1002/pmic.200500081. PMID 16220535. S2CID 23396231. Arhivirano s originala, 5. 1. 2013.
^ Gavin P.D.; Devenish R.J.; Prescott M. (2003). "FRET reveals changes in the F₁–stator stalk interaction during activity of F₁F₀-ATP synthase". Biochim Biophys Acta. 1607 (2–3): 167–79. doi:10.1016/j.bbabio.2003.09.013. PMID 14670607.
^ Kastenholz, B. (2004). "Preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis (PNC‐PAGE): an efficient method for isolating cadmium cofactors in biological systems". Protein Pept Lett. 37 (4): 657–65. doi:10.1081/AL-120029742. S2CID 97636537.

Vanjski linkovi

Educational resource for protein electrophoresis
Gel electrophoresis of proteins Arhivirano 26. 1. 2021. na Wayback Machine

Šablon:Elektroforeza

[1] Schägger, H.; Jagow, G. (1991). "Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form". Anal. Biochem. 199 (2): 223–231. doi:10.1016/0003-2697(91)90094-A. PMID 1812789.

[2] Wittig, I.; Braun, H.P.; Schägger, H. (2006). "Blue native PAGE". Nat. Protoc. 1 (1): 418–428. doi:10.1038/nprot.2006.62. PMID 17406264. S2CID 19715017.

[3] Wittig, I.; Schägger, H. (Nov 2005). "Advantages and limitations of clear-native PAGE". Proteomics. 5 (17): 4338–46. doi:10.1002/pmic.200500081. PMID 16220535. S2CID 23396231. Arhivirano s originala, 5. 1. 2013.

[4] Gavin P.D.; Devenish R.J.; Prescott M. (2003). "FRET reveals changes in the F₁–stator stalk interaction during activity of F₁F₀-ATP synthase". Biochim Biophys Acta. 1607 (2–3): 167–79. doi:10.1016/j.bbabio.2003.09.013. PMID 14670607.

[5] Kastenholz, B. (2004). "Preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis (PNC‐PAGE): an efficient method for isolating cadmium cofactors in biological systems". Protein Pept Lett. 37 (4): 657–65. doi:10.1081/AL-120029742. S2CID 97636537.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]