Northern blot
Northern blot ili RNK blotiranje[1] jest metodska tehnika koja se koristi u molekulskobiološkom istraživanju za proučavanje ekspresije gena, otkrivanjem RNK (ili izolirane iRNK) u uzorku.[2][3]
Northern blotiranjem moguće je promatrati ćelijsku kontrolu nad strukturom i funkcijom, određivanjem određenih stopa ekspresije gena tokom diferencijacije i morfogeneze, kao i u abnormalnim ili bolesnim stanjima.[4] Northern blot uključuje upotrebu elektroforeze za odvajanje uzoraka RNK po veličini i detekciju pomoću sonde za hibridizaciju komplementarne dijelu ili čitavoj ciljnoj sekvenci. Termin "Northern blot" zapravo se posebno odnosi na kapilarni prijenos RNK iz gela za elektroforezu u membranu za blotiranje. Međutim, čitav se postupak obično naziva Northern blotiranjem.[5] Tehniku northern blot razvio je James Alwine, 1977, David Kemp i George Stark na Stanford University,[6] . Northern bloting imenovan je po sličnosti s prvom tehnikom blogtiranja, Southern blot, nazvanom po biologu Edwinu Sauthernu.[2] Glavna razlika je u tome što se u northern blotu analizira RNK, umjesto DNK.[7]
Primjena
urediNorthern bloting omogućava uočavanje određenog uzorka ekspresije gena između tkiva, organa, razvojnih stadija, nivoa stresa u okruženju, infekcije patogenima i tokom liječenja.[8] Tehnika se koristi za prikazivanje prekomjerne ekspresije onkogena i smanjenja regulacije gena za supresiju tumora u ćelijama karcinoma, u odnosu na 'normalno' tkivo, kao i ekspresija gena u odbacivanju presađenih organa.[9]
Ako se nadregulirani gen opaža obiljem iRNK na northern blotingu, uzorak se zatim može sekvencirati kako bi se utvrdilo je li gen poznat ili je novo otkriće.[9] Obrasci ekspresije dobijeni pod datim uslovima mogu pružiti uvid u funkciju tog gena. Budući da se RNK prvo razdvaja po veličini, ako se koristi samo jedan tip sonde, odstupanje u nivou svake trake na membrani može pružiti uvid u veličinu proizvoda, što sugerira alternativne prerađene proizvode istog gena ili motive koji se ponavljaju. Varijacija u veličini genskog proizvoda takođe može ukazivati na deleciju ili greške u obradi transkripata. Promjenom cilja sonde korištenog duž poznate sekvence moguće je utvrditi koja regija RNK nedostaje.[2]
Obrnuti northern blot
urediIstraživači povremeno koriste varijantu postupka poznatu kao obrnuti northern blot. U ovom postupku, supstratna nukleinska kiselina (koja je pričvršćena na membranu) je skup izoliranih fragmenata DNK, a sonda je RNK ekstrahirana iz tkiva i radioaktivno označena.
Upotreba DNK-mikrozraka koje su postale široko rasprostranjeni krajem 1990-ih i početkom 2000-ih srodnija je obrnutom postupku, jer uključuju upotrebu izoliranih fragmenata DNK, pričvršćenih na podlogu i hibridizaciju sa sondom napravljenom od ćelijske RNK. Stoga je obrnuti postupak, iako prvotno neuobičajen, omogućio norfthern analizi da preraste u profiliranje ekspresije gena, u kojem se može nadzirati njihova ekspresija mnogim (možda svim) genima u organizmu.
Također pogledajte
urediReference
uredi- ^ Gilbert, S. F. (2000) Developmental Biology, 6th Ed. Sunderland MA, Sinauer Associates.
- ^ a b c Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2008. Molecular Biology of the Cell, 5th ed. Garland Science, Taylor & Francis Group, NY, pp 538–539.
- ^ Kevil, C. G., Walsh, L., Laroux, F. S., Kalogeris, T., Grisham, M. B., Alexander, J. S. (1997) An Improved, Rapid Northern Protocol. Biochem. and Biophys. Research Comm. 238:277–279.
- ^ Schlamp, K.; Weinmann, A.; Krupp, M.; Maass, T.; Galle, P. R.; Teufel, A. (2008). "BlotBase: A northern blot database". Gene. 427 (1–2): 47–50. doi:10.1016/j.gene.2008.08.026. PMID 18838116.
- ^ Trayhurn, P. (1996) Northern Blotting. Pro. Nutrition Soc. 55:583–589.
- ^ Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (1977). "Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (12): 5350–4. doi:10.1073/pnas.74.12.5350. PMC 431715. PMID 414220.
- ^ Bor, Y.C.; Swartz, J.; Li, Y.; Coyle, J.; Rekosh, D.; Hammarskjold, Marie-Louise (2006). "Northern Blot analysis of mRNA from mammalian polyribosomes". Nature Protocols. doi:10.1038/nprot.2006.216.
- ^ Baldwin, D., Crane, V., Rice, D. (1999) A comparison of gel-based, nylon filter and microarray techniques to detect differential RNA expression in plants. Current Opinion in Plant Biol. 2: 96–103.
- ^ a b Utans, U.; Liang, P.; Wyner, L. R.; Karnovsky, M. J.; Russel, M. E. (1994). "Chronic cardiac rejection: Identification of five upregulated genes in transplanted hearts by differential mRNA display". Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91 (14): 6463–6467. doi:10.1073/pnas.91.14.6463. PMC 44222. PMID 8022806.
Vanjski linkovi
uredi