Razlika između verzija stranice "Southern blot"

[[slika:Aufbau Southern-Blot.jpg|thumb| Pladanj sa hrpom koja se sastoji od utega, papirnatih peškira, [[vještačka membrana | membrana]] od [[nitroceluloza|nitroceluloze]] ili [[najlon]]a, [[gel]]a, rastvora [[soli]] i staklene ploče.]]

| date = 5. November11. 1975

}}</ref> Ostali metodi blotiranja (tj. [[western blot]], <ref>{{cite journal | last1 = Towbin | last2 = Staehelin | first2 = T | last3 = Gordon | first3 = J | display-authors = etal | year = 1979 | title = Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications | journal = PNAS | volume = 76 | issue = 9| pages = 4350–4 | doi = 10.1073/pnas.76.9.4350 | pmid = 388439 | pmc=411572}}</ref> [[northern blot]], [[eastern blot]], [[southwestern blot]]) koji koriste slične principe, ali za [[RNK]] ili [[protein]]e, kasnije su imenovani u odnosu na ime Edwina Southerna. Kako je oznaka [[eponim]]na, Southern se označava velim početnim slovom, kao što je uobičajeno za [[vlastite imenice]]. Nazivi za druge metode blotiranja mogu slijediti ovu konvenciju, po analogiji.<ref>{{cite journal

|date=Aprilapril 1981

# Ako se koriste metode prijenosa pomoću alkalnih supstanci, DNK gel se stavlja u alkalni rastvor (koji obično sadrži [[natrij-hidroksid]]) da bi se denaturirala dvolančana DNK. Denaturacija u alkalnom okruženju može poboljšati vezivanje negativno nabijenih [[timin]]skih ostataka DNK na pozitivno nabijene amino-grupe vještačke membrane, razdvajajući ih u pojedinačne DNK lance za kasnije [[hibridizacija nukleinske kiseline | hibridiziraju]] na sondu (vidi dolje) i uništava bilo koja preostala RNK koja je još uvijek prisutna uz DNK. Izbor alkalnih umjesto neutralnih metoda prijenosa, međutim, često je empirijski i može rezultirati ekvivalentnim rezultatima.

# List [[nitroceluloza|nitroceluloze]] (ili, alternativno, [[najlon]]a) [[vještačka membrana| membrane]] postavlja se na vrh (ili ispod, ovisno o smjeru prijenosa) gela. Pritisak se ravnomjerno primjenjuje na gel (bilo usisavanjem, bilo postavljanjem snopa papirnatih maramica i tegova na vrh membrane i gela), kako bi se osigurao dobar i ravnomjeran kontakt između gela i membrane. Ako se prenos vrši usisavanjem, koristi se [[SSC pufer|20X SSC]] pufer kako bi se osiguralo zatvaranje i sprečilo sušenje gela. Prenos pufera [[kapilar|kapilarnim djelovanjem]] iz područja sa visokim [[vodeni potencijal|vodenim potencijalom]] u područje sa malim vodenim potencijalom (obično filter papir i papirnati uložak) koristi se za premještanje DNK iz gela na membranu; [[ionska izmjena]] interakcije veže DNK za membranu, zbog negativnog naboja DNK i pozitivnog naboja membrane.

# Membrana se zatim izlaže [[hibridizacijska sonda|hibridizacijskoj sondi]] – jednom DNK fragmentu sa određenom sekvencom čije prisustvo u ciljnoj DNK treba utvrditi. DNK sonda je označena tako da se može detektirati, obično ugrađivanjem [[radioaktivnost|radioaktivnog markera]] ili označavanjem molekula [[fluorescencija| fluorescentncijom]] ili [[hromogena hibridizacija in situ|hromogenom bojom]]. U nekim slučajevima, sonda za hibridizaciju može se napraviti od RNK, a ne od DNK. Da bi se osigurala specifičnost vezivanja sonde za DNK uzorka, najčešći metodi hibridizacije koriste DNK sperme lososa ili haringe, za blokiranje površine membrane i ciljane DNK, deionizirani [[formamid]] i deterdžent, kao što je [[natrij-dodecil sulfat|SDS]], za smanjenje nespecifičnog vezivanja sonde.