Razlika između verzija stranice "Polimerazna lančana reakcija"

'''Polimerazna lančana reakcija''' (eng. '''P'''olymerase '''C'''hain '''R'''eaction: '''[[PCR]]'''), jeste lančana reakcija umnožavanja polimerazom.<ref>{{Cite web|url=https://www.britannica.com/science/polymerase-chain-reaction|title=polymerase chain reaction {{!}} Definition & Steps|website=Encyclopedia Britannica|language=en|accessdate=2020-04-04}}</ref> Lančana sinteza polimerazom, amplifikacija polimerazom ili polimerazna amplifikacija, uobičajeno ''PCR'', samo su neki od oblika prevoda izvornog naziva tehnike koja je doslovno izazvala revoluciju u oblasti [[molekula|molekulske]] [[genetika|genetike]] i [[biologija|biologije]] uopće. Polazna količina DNK, koja je decenijama predstavljala ograničavajući faktor u istraživanjima, svela se na potrebu prisustva samo jedne dobro očuvane molekule a mukotrpne procedure izolacije i prečišćavanja dijelova genoma postale su jednostavnije. Pred istraživačima su se naglo otvorile nove mogućnosti. Pored toga, gotovo da ne postoji društvena djelatnost koju ova tehnika nije direktno ili indirektno dotakla i zauvijek izmijenila. Glavni “krivci” za ovakvu pometnju su Kary Mullis<ref>{{Cite web|url=https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/1993/mullis/facts/|title=The Nobel Prize in Chemistry 1993|website=NobelPrize.org|language=en-US|accessdate=2020-04-04}}</ref> i njegovi suradnici iz Odjela za humanu genetiku Korporacije Cetus. U časopisu Science 1985. godine objavili su rad u kojem prvi put opisuju tehniku specifičnog umnožavanja fragmenta DNK ''[[in vitro]]'' kataliziranog enzimom DNK polimeraza porijeklom iz Escherichia coli. U istom časopisu 1988. godine isti tim naučnika publicira rad u kome umjesto navedene polimeraze E. coli uvode termostabilnu DNK polimerazu I izolovanu iz bakterije Thermus aquaticus (Taq). Unatoč brojnim modifikacijama, raznovrsnim primjenama i automatizaciji procesa lančane sinteze polimerazom, osnovne odrednice ove tehnike utemeljene 1985. godine i 1988. godine nisu se značajnije izmijenile.<ref>Old, R. W., Primrose, S. B. (1994): Principles of gene manipulation. An introduction to genetic engineering. Blackwell Scientific Publications, Oxford.</ref>

Pošavši od ovih premisa, Mullis (1993) je pretpostavio da može postići umnožavanje specifičnog dijela DNK molekule koji leži između dva regiona čija je sekvenca poznata. Selekcija specifičnog dijela DNK molekule postiže se primjenom oligonukleotidnih prajmera, kratkih DNK sekvenci (20–30 nukleotida) koje su komplementarne krajevima definirane sekvence. U tipičnoj PCR reakciji učestvuju dva prajmera sintetizirana u 5’3’–pravcu, tako da se na njihovom 3’–kraju nalazi dezoksiriboza sa slobodnom –OH–grupom i obično se obilježavaju sa F (forward) i R (reverse). Na temperaturi od 95 oC pucaju vodikove veze koje održavaju dvolančanu strukturu molekule čiji se dio umnožava (template DNA = matrica) te se ona denaturiše. Spuštanjem temperature stvaraju se uvjeti za renaturaciju, ali i za formiranje hibridnih molekula matrica–prajmer. DNK Pol I pronalazi takve hibride i pod odgovarajućim uvjetima katalizira vezivanje fosfatne grupe dezoksinukleotid–3–fosfata za 3’–OH–grupu dezoksiriboze prajmera prema konstanti komplementarnosti. Rezultat je sintetiziran naspramni lanac komplementaran matrici koji može poslužiti kao matrica drugom prajmeru. Ovaj ciklus denaturacije zagrijavanjem, renaturacije hlađenjem i sinteze naspramnog lanca može se ponavljati a svaki novosintetizirani lanac postaje matrica u narednom ciklusu. Također, sa porastom broja ciklusa eksponencijalno raste broj molekula specifično umnožavanog dijela DNK. Teorijski broj molekula ciljane sekvence koja se sastoji od sekvence prajmera i dijela DNK molekule između prajmerskih sekvenci, iznosi 2n–2n (n = broj ciklusa) za svaku molekulu DNK matrice. Također teorijski, od jedne jedine molekule se, u 30 ciklusa, može dobiti 230–2*30 = 1.073.741.764 ciljanih fragmenata. Ponavljanje ciklusa može biti efikasno sve dok ne nastane deficit neke od komponenti (prajmera, nukleotid–3–fosfata ili enzima). Ovisno od svrhe reakcije, veličine umnožavanog dijela DNK i željene koncentracije, tipična ''PCR'' reakcija se odvija u 30–40 ciklusa.