Imunoflurescencija
Imunofluorescencija je tehnika koja se koristi za svjetlosnu mikroskopiju sa fluorescentnim mikroskopom i koristi se prvenstveno na mikrobiološkim uzorcima. Ova tehnika koristi specifičnost antitijela za njihov antigen za ciljanje fluorescentne boje na određene biomolekulske mete unutar ćelije, pa stoga omogućava vizualizaciju distribucija ciljne molekule uzorka. Specifična regija koju antitijelo prepoznaje na antigenu naziva se epitop.[1] There have been efforts in epitope mapping since many antibodies can bind the same epitope and levels of binding between antibodies that recognize the same epitope can vary.[2] Osim toga, vezivanje fluorofora za samo antitijelo ne može ometati imunološke specifičnosti antitijela ili sposobnost vezivanja njegovog antigena. Imunofluorescencija je široko korišteni primjer imunobojenja (pomoću antitijela za bojenje proteina) i specifičan je primjer imunohistoehmije (upotreba odnosa antitijela i antigena u tkivima). Ova tehnika prvenstveno koristi fluorofore za vizualizaciju lokacije antitijela.[3]
Koža je od pacijenta sa poremećajem Henoch-Schönleinova purpura: IgA naslage se nalaze u zidovima malih površinskih kapilara (žute strelice).
Blijedo valovito zeleno područje na vrhu je epiderma, donje vlaknasto područje je derma.
Nasuprot tome, sekundarna imunofluorescencija prikazana je desno, što pokazuje da se prvo neoznačeno primarno antitijelo veže za epitop antigena u mehanizmu sličnom onom opisanom gore. Međutim, nakon što se primarna antitijela vežu za cilj, dolazi do sekundarnog antitijela (označenog fluoroforom). Mjesta vezivanja ovog sekundarnog antitijela su specifična za primarno antitijelo, koje je već vezano za antigen, pa se sekundarno antitijelo veže za primarno antitijelo.
Ovaj metod omogućava da se više antitijela označenih fluoroforom vežu za njihovu metu, povećavajući tako fluorescentni signal tokom mikroskopije.
Imunofluorescencija se može koristiti na presjecima tkiva, kultiviranim ćelijskim linijama ili pojedinačnim ćelijama, a može se koristiti i za analizu distribucije protein, glikana, te malih bioloških i nebioloških molekula. Ova tehnika se čak može koristiti i za vizualizaciju struktura poput niti srednje veličine.[4] Ako topologija ćelijske membrane tek treba biti utvrđena, može se upotrijebiti insercija epitopa u proteine, zajedno s imunofluorescencijom za određivanje struktura.[5] Imunofluorescencija se također može koristiti kao "polukvantitativni" metod za stjecanje uvida u razine i lokalizacijske obrasce metilacije DNK, budući da je to metod kojo oduzima više vremena od pravih kvantitativnih metoda, a postoji i određena subjektivnost u analizi nivoa metilacija.[6] Imunofluorescencija se može koristiti u kombinaciji s drugim metodima fluorescentnog bojenja koje nisu na bazi antitijela, naprimjer, upotrebom DAPI za označavanje DNK. Za analizu imunofluorescentnih uzoraka može se koristiti nekoliko dizajna mikroskopa; najjednostavniji je epifluorescentni mikroskop, a konfokusmi mikroskop se također široko koristi. Mogu se koristiti i različiti superrezolucijski dizajni mikroskopa koji su sposobni za mnogo veću rezoluciju.[7]
Također pogledajte uredi
Reference uredi
- ^ Mandrell, R. E.; Griffiss, J. M.; Macher, B. A. (1. 7. 1988). "Lipooligosaccharides (LOS) of Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis have components that are immunochemically similar to precursors of human blood group antigens. Carbohydrate sequence specificity of the mouse monoclonal antibodies that recognize crossreacting antigens on LOS and human erythrocytes". Journal of Experimental Medicine (jezik: engleski). 168 (1): 107–126. doi:10.1084/jem.168.1.107. ISSN 0022-1007. PMC 2188965. PMID 2456365.
- ^ Ladner, Robert C. (1. 1. 2007). "Mapping the Epitopes of Antibodies". Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 24 (1): 1–30. CiteSeerX 10.1.1.536.6172. doi:10.1080/02648725.2007.10648092. ISSN 0264-8725.
- ^ "Immunofluorescence". Protocol Online.
- ^ Franke, W. W.; Schmid, E.; Osborn, M.; Weber, K. (1. 10. 1978). "Different intermediate-sized filaments distinguished by immunofluorescence microscopy". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (10): 5034–5038. doi:10.1073/pnas.75.10.5034. ISSN 0027-8424. PMC 336257. PMID 368806.
- ^ Wang, Honggang; Lee, Eun-Woo; Cai, Xiaokun; Ni, Zhanglin; Zhou, Lin; Mao, Qingcheng (30. 12. 2008). "Membrane Topology of the Human Breast Cancer Resistance Protein (BCRP/ABCG2) Determined by Epitope Insertion and Immunofluorescence". Biochemistry. 47 (52): 13778–13787. doi:10.1021/bi801644v. ISSN 0006-2960. PMC 2649121. PMID 19063604.
- ^ Çelik, Selcen (1. 1. 2015). "Understanding the complexity of antigen retrieval of DNA methylation for immunofluorescence-based measurement and an approach to challenge". Journal of Immunological Methods. 416: 1–16. doi:10.1016/j.jim.2014.11.011. PMID 25435341.
- ^ "Immunofluorescence Method". Davidson College.
Vanjski linkovi uredi
- Images associated with autoimmune diseases Arhivirano 25. 9. 2009. na Wayback Machine at University of Birmingham
- Immunofluorescence Staining Protocol Arhivirano 21. 8. 2008. na Wayback Machine
- Overview at Davidson College
- Immunofluorescence na US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)
- SynD - Automatic synapse and neurite detection in immuno-fluorescence images